Die autosomal-rezessiv vererbte Fanconi Anämie gilt als Modellsystem für den Zusammenhang zwischen Sauerstoffempfindlichkeit und genetischer Instabilität, der sich durch kongenitale Fehlbildungen, Knochenmarksversagen und erhöhtes Neoplasie-Risiko manifestiert. Dem Krankheitsbild liegen Mutationen in zumindest 5 verschiedenen Genen zu grunde. Zellbiologisch sowie mit Hilfe eines Shuttle-Vektor Systems konnten wir die Sauerstoffüberempfindlichkeit bei FA definieren und den Zusammenhang mit einem charakteristischen und diagnostischen Zellzyklusdefekt nachweisen.

Wir konnten ferner zeigen, daß zumindest das FAC-Gen mit p53 interagiert und damit eines der Target-Gene sein kann, welches bei Zellschädigung aktiviert wird. Gegenwärtig suchen wir mit Hilfe des differential display of mRNA Systems nach Kandidatengenen für Zellen der Komplementationsgruppe E (A1 - A13).

Kooperationen
Joenje H. Freie Universität, Amsterdam
Gross HJ, Institut für Biochemie, Würzburg
Grummt F, Institut für Biochemie, Würzburg
Digweed M, Virchow-Klinikum, Berlin
Krone W, Universität, Ulm
Kubbies M, Boehringer Mannheim, Penzberg
Stopper H, Institut für Toxikologie, Würzburg

Genetische Faktoren spielen eine wichtige Rolle bei menschlichen Alterungsprozessen. Auf zellulärer Ebene manifestieren sich Alterungsvorgänge oft als Störungen der Zellproliferation. Als Modellsystem dienen Zellen von Patienten mit dem autosomal-rezessiv vererbten Werner-Syndrom (adulte Progerie). Zellen dieser Patienten zeigen eine stark verkürzte Lebensspanne und erhöhte genetische Instabilität, deren Ursachen im Rahmen dieses Projektes aufgeklärt werden sollen (A14 - A24).

Kooperationen
Martin GM, Univ of Washington, Seattle
Rabinovitch PS, Univ. of Washington, Seattle
Riederer P, Univ.-Nervenklinik, Würzburg

In der Arbeitsgruppe Experimentelle Zytogenetik wurden im Zeitraum 1995 - 1997 im wesentlichen folgende vier Forschungsschwerpunkte bearbeitet:

• Molekularzytogenetische Untersuchungen über die Säugetier-Spermiogenese (Prof. Dr. Michael Schmid; Dr. Martina Guttenbach; Daniela Bunsen)

• Genlokalisation in Vogelchromosomen (Prof. Dr. Michael Schmid; Dr. Indrajit Nanda)

• Molekularbiologische und zytogenetische Analysen zur Geschlechtsbestimmung bei Fischen (Prof. Dr. Michael Schmid; Dr. Michael Köhler)

• Chromosomen-Evolution bei Vertebraten (Prof. Dr. Michael Schmid; Dr. Wolfgang Feichtinger; Claus Steinlein)

Zusammenarbeit:
Prof. Dr. W. Engel, Prof. Dr. H.W. Michelmann (Göttingen)
Dr. Köhn (Giessen)
Prof. Dr. C. Jungwirth (Würzburg)
Dr. J. Kaufmann (Basel)
Prof. Dr. M. Schartl (Würzburg)
PD T. Haaf (Berlin)
Prof. Dr. H. Koepsell (Würzburg)
Prof. Dr. H.C. Macgregor (Leicester)

In der Spermatogenese differenzieren sich die haploiden Spermien aus diploiden Spermatozyten. Meiose und Spermiohistogenese sind die beiden entscheidenden Prozesse, die bei allen männlichen Wirbeltieren den normalen Ablauf der Spermatogenese bestimmen. Beide Prozesse entwickeln eine Reihe spezifischer Zellbestandteile und Aufgaben, die in somatischen Zellen nicht vorhanden sind. Genetisch bedingte Störungen der Meiose und Spermiohistogenese sind häufige Ursachen männlicher Infertilität. Ein großer Teil dieser Störungen läßt sich auf Veränderungen der normalen Struktur und/oder Funktion ganzer Chromosomen oder chromosomenassoziierter Strukturen zurückführen und ist daher auf lichtmikroskopischer Ebene zu erfassen. In diesem Projekt werden mit Hilfe molekularzytogenetischer Methoden (insbesondere in situ Hybridisierungs-Techniken) folgende Fragestellungen untersucht:

1. Entstehungsmechanismen genetischer Veränderungen (numerische Chromosomenaberrationen) in männlichen Keimzellen, die zu Frühaborten oder kindlichen Fehlbildungen führen

2. Anordnung und Funktion von Chromosomen in der Spermiogenese und in Spermiogenese-assoziierten Zellen

3. Charakterisierung normaler und aberranter Spermiogenese-Stadien durch spezifische Antikörper mit immunzytogenetischen Methoden

4. Zytogenetik von Sertoli- und Leydigzellinien

(B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7; Michelmann HW, Hinney B, Guttenbach M, Schmid M, noch nicht veröffentlicht; Kruse R, Guttenbach M, Schartmann B, Schubert R, van der Ven H, Schmid M, Propping P, noch nicht veröffentlicht)

Im Vordergrund des Vorhabens steht die physikalische Lokalisierung von Genen in den Chromosomen von Vögeln mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). Als Modellorganismus wurde das Haushuhn gewählt, da dieses bei genetischen, embryologischen und molekularbiologischen Untersuchungen eine zentrale Stellung einnimmt und desweiteren eine wichtige Rolle in den Agrarwissenschaften spielt. Die erforderlichen DNAProben werden von kooperierenden Arbeitsgruppen in den USA, England, Frankreich und Japan erhalten. Seit Beginn dieses Forschungsvorhabens wurden in unserer Arbeitsgruppe mehr als 30 Gene bzw. Genkomplexe und 12 repetitive DNA-Sequenzen in Mikro- und Makrochromosomen des Huhns lokalisiert. Überraschenderweise deutet sich an, daß die Gendichte in den Mikrochromosomen größer ist als in den Makrochromosomen (B8, B9, B10, B11).

Bei einigen kommerziell zur Zucht verwendeten Fischarten mit geschlechtlicher Fortpflanzung zeigte es sich, daß Fische, die in getrennt-geschlechtlichen Populationen kultiviert werden, größer werden als solche in gemischt-geschlechtlichen Populationen. Häufig läßt sich aber das Geschlecht der Fische phänotypisch erst beim ausgewachsenen Tier erkennen. Wünschenswert für die Fischzucht ist somit eine möglichst frühzeitige Geschlechtsbestimmung anhand zytogenetischer oder molekularer Marker, was auch bei einigen Fischen durch deutlich differenzierbare Geschlechtschromosomen im Karyotyp realisierbar ist. Andere Fischarten weisen aber in ihrem Karyotyp keine mit traditionellen Methoden erkennbaren, heteromorphen Geschlechtschromosomen auf. In diesem Projekt wird deshalb versucht, moderne molekulargenetische und zytogenetische Methoden auf das Fischsystem anzuwenden, um so bislang nicht differenzierbare Geschlechtschromosomen darstellen zu können (B12, B13, B14, B15, B16, B17, B20).

Im Vordergrund dieses Projektes stehen Untersuchungen über die Entstehung von Geschlechtschromosomen. Als Untersuchungsmaterial steht fixiertes Chromosomen-Material von Fischen, Amphibien, Reptilien und Säugetieren zur Verfügung, welches auf verschiedenen Sammelexkursionen in Südamerika und Australien präpariert, bzw. von kooperierenden Instituten zur Verfügung gestellt wurde. Die vergleichenden zytogenetischen Untersuchungen zeigen, daß in der Mehrzahl der niederen Wirbeltiere die XY-, bzw. ZW-Geschlechtschromosomen noch homomorph, d.h. lichtmikroskopisch nicht voneinander unterscheidbar sind. Bei einigen wenigen Spezies jedoch kann verfolgt werden, daß sich die Y- bzw. W-Chromoosmen durch Anreicherung von repetitiven DNA-Sequenzen differenzieren. Durch diese initiale Differenzierung werden die Crossing-over in der Meiose des heterogametischen Geschlechts unterbunden (B19, B20, B21, B22).

Die Alkaptonurie (AKU) ist das Paradigma für eine angeborene Stoffwechselstörung, die bereits Garrod 1908 als Beispiel für sein Konzept der "inborn errors of metabolism" gedient hat. Im Abbau der aromatischen Aminosäuren ist der Schlüsselschritt, die irreversible oxidative Spaltung der Homogentisinsäure, durch einen Enzymdefekt blockiert. Dadurch wird Homogentisinsäure in großen Mengen mit dem Harn ausgeschieden, der sich durch Autoxidation der Homogentisinsäure schwarz färbt. Diese urina nigra taucht bereits in der älteren medizinischen Literatur auf, da sie eine der wenigen persistierenden Verfärbungen des Urins mit guter Prognose darstellt. Überschüssige Homogentisinsäure lagert sich ferner in Form von kohlschwarzen Polymeren in Bindegewebe und Knorpeln ab. Diese pathognomonische "Ochronose", die zuerst von Virchow beschrieben wurde, führt im Lauf der Jahre zu schmerzhaften, arthritischen Beschwerden der grossen Gelenke. Ansonsten sind die Patienten beschwerdefrei und vor allem die geistige Entwicklung ist nicht beeinträchtigt.

Im Jahre 1990 wurde am Pasteur-Institut, Paris, eine homologe Mausmutante (Abb. 1) identifiziert und das zugehörige Gen auf Chromosom 16 kartiert. Wegen der Konservierung von Chromosomenregionen im Laufe der Evolution war es möglich, Vorhersagen über die Lokalisation des menschlichen Gens zu machen. Tatsächlich konnten wir das menschliche AKU-Gen durch Koppelungsanalyse in slowakischen Alkaptonuriefamilien auf Chromosom 3q kartieren (C6), einem der Bereiche, die Homologien zum Mauschromosom 16 aufweisen.

Parallel dazu haben wir das Enzym Homogentisat-1,2-dioxygenase aus Mausleber mit konventionellen chromatographischen Methoden zur Homogenität gereinigt (C15). Am Lehrstuhl für Physiologische Chemie II (Dr. V. Hoppe, Prof. J. Hoppe) wurde eine partielle Aminosäuresequenz des Proteins erstellt. Daraus haben wir degenerierte Primer zur Amplifikation von Teilen der mRNA aus Mausleber abgeleitet. Aus einer cDNA-Bank konnte schliesslich die komplette cDNA isoliert werden. Inzwischen ist das murine cDNA vollständig sequenziert, und seine Identität mit dem Gen für Homogentisat-1,2-dioxygenase bewiesen worden (C36).

Durch Datenbank-Suche konnten wir mehrere menschliche EST-Klone (Expressed Sequence Tag) identifizieren, die Homologie zu der Maus-cDNA aufwiesen. Einer dieser Klone enthielt die komplette cDNA-Sequenz des menschlichen Gens, so dass wir auf weitere Klonierungsexperimente verzichten konnten. Die Gene von Mensch und Maus weisen eine Homologie von mehr als 92 % auf. Nach Etablierung der Exon-Intron-Grenzen konnten wir die ersten Mutationen in der genomischen DNA von AKU-Patienten nachweisen (C37). Bei den menschlichen Patienten finden sich sowohl "nonsense" als auch "missense"-Mutationen, bei der Maus führt eine Spleiss-Mutation zum Überspringen des Exons 12 in der mRNA und damit zum Verlust einer offenbar funktionell wichtigen Proteindomäne.Derzeit versuchen wir, einige der missense Mutationen in vitro zu exprimieren, um deren inaktivierenden Effekt zu demonstrieren und Aufschlüsse über wichtige Funktionsbereiche des Proteins zu erhalten.

Die Muskeldystrophie Duchenne ist die häufigste progressive Muskelerkrankung des Kindesalters. Verantwortlich sind Mutationen (meist große Deletionen, seltener Punktmutationen) des riesigen Dystrophin-Gens (2.5 Mb), das für ein Zytoskelettprotein der Muskelzellen kodiert (Abb. 2). Eine hohe Mutationsrate führt immer wieder zu Neuerkrankungen in Familien ohne genetische Vorbelastung.

Auf molekularer Ebene konnten wir durch die Analyse einer großen Zahl von Patienten zeigen, daß sowohl Deletionen als auch Punktmutationen über das ganze Dystrophin-Gen verteilt vorkommen, wobei zwei Hot-spots für Deletionen erkennbar sind. Durch Sequenzierung von individuellen Deletionsbruchpunkten konnten wir wahrscheinlich machen, daß Replikationsfehler an der Entstehung von Deletionen beteiligt sein können. Die Deletions-Hot-spots liegen an den Übergängen von Bereichen mit ausgeprägten Unterschieden im GC-Gehalt (Isochoren), so daß eine Instabilität der Chromatinstruktur vermutet werden kann.

Zusammen mit der Abt. Medizinische Genetik (Grimm) konnten wir anhand von epidemiologischen Daten feststellen, daß Punktmutationen überwiegend in der Spermatogenese, Deletionen hingegen vorwiegend in der Oogenese stattfinden müssen (C7). Damit erklärt sich das alte Paradox der scheinbar gleichen Mutationsraten in den Geschlechtern für die Muskeldystrophie Duchenne. In zahlreichen epidemiologischen Studien war immer wieder bestätigt worden, dass für diese Erkrankung die Neumutationsraten in männlichen und weiblichen Gameten nahezu gleich sind. Dies schien allen biologischen Überlegungen zu widersprechen: da die männlichen Keimzellen bis zur Reifung ca. 10 mal so viele Teilungen durchlaufen wie die weiblichen, wurde allgemein angenommen, dass sich Mutationen in männlichen Gameten mit der Zeit anhäufen (Alterseffekt; bekanntestes Beispiel ist die königliche Neumutation des 52jährigen Duke of Kent, die Queen Victoria zur Überträgerin der Hämophilie gemacht hat). Die Duchenne-Muskeldystrophie schien diese Lehrbuchregel zu durchbrechen. Durch den Nachweis, dass die beiden Mutationstypen (grosse Deletionen bzw. Punktmutationen) "geschlechtsspezifisch" entstehen, ergibt sich in der Summe eine scheinbar gleiche Mutationsrate.

Maligne Hyperthermie (MH) ist eine genetische Prädisposition zu extremen Reaktionen auf Inhalationsnarkotika und Muskelrelaxantien wie sie heute routinemässig zur Einleitung einer Narkose verwendet werden. Die Patienten reagieren mit rascher Temperaturerhöhung, Hypermetabolismsus, Hypoxie und Muskelstarre, Symptome, die beim Ausbleiben von Gegenmaßnahmen in kurzer Zeit zum Tode führen können. Obwohl die Disposition an sich selten ist und mit Dantrolen ein wirksames Gegenmittel zur Verfügung steht, ist die Maligne Hyperthermie immer noch die häufigste lebensbedrohende Narkosekomplikation. Die genetische Prädisposition für die MH, die im Alltag keinen Krankheitswert hat, wird autosomal dominant vererbt. Ein erster Genlocus für die MH konnte auf Chromosom 19 kartiert und ein Kandidatengen, der Ryanodin-Rezeptor (RYR1) identifiziert werden. RYR1 ist eine Kalzium-Kanal des sarkoplasmatischen Retikulums, der für den Ausstrom von Kalziumionen bei der Muskelkontraktion verantwortlich ist. In Zusammenarbeit mit PD Dr. E.J. Hartung vom Institut für Anästhesiologie Würzburg und der European Malignant Hyperthermia Group konnten wir im RYR1-Gen einige Mutationen charakterisieren, die zu MH prädisponieren (C4, C10). MH ist jedoch genetisch heterogen. Im Rahmen einer genom-weiten Koppelungsanalyse mit hochpolymorphen Markern konnten zwei weitere Genloci kartiert werden (C16, C17, C38).

Central Core Disease (CCD) ist eine seltene, erbliche Muskelschwäche, die häufig mit der Disposition zur MH einhergeht. Der Name rührt von der typischen, fokalen Auflösung der Myofibrillen in den Muskelzellen her, die das histologische Kennzeichen der CCD ist (Abb. 3). Wir konnten zeigen, daß das für CCD verantwortliche Gen ebenfalls auf dem Chromosom 19 im Bereich des RYR1-Gens lokalisiert ist. Präsumptive Mutationen des RYR1-Gens wurden sowohl in MH- als auch in CCD-Familien gefunden (C4). Es ist allerdings von der Physiologie her nicht leicht zu verstehen, wie Mutationen ein und desselben Proteins einerseits zur Übererregbarkeit (MH) und andererseits zur Muskelschwäche durch Erregungsstörung (CCD) führen könnten. Alternativ könnten die beiden Krankheiten auch von getrennten Genen verursacht werden, die auf dem Chromosom 19 nahe beieinander liegen. Wir wollen daher alle Gene dieses Chromosomenabschnitts identifizieren, die in der Skelettmuskulatur exprimiert werden.

Der Begriff Kraniosynostosen wurde 1851 von Virchow in Würzburg geprägt und beschreibt den vorzeitigen Verschluß von Schädelnähten. Je nachdem welche Nähte sich vorzeitig verschließen und welche dafür kompensatorisch aufgeweitet werden, ergibt sich eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Deformation des Schädels. In der Regel führt dies zu einem erhöhten intrakraniellen Druck, u.U. auch zu Papillenödemen, die dem Sehnerv schädigen können. Eine operative Korrektur sollte daher möglichst im ersten Lebensjahr erfolgen.

Mit einer Häufigkeit von 1 : 2000 - 1 : 3000 sind sie keine seltenen Fehlbildungen. Von den über 100 Syndromen mit Kraniosynostose werden etwa 30 monogen vererbt.

Anhand der betroffenen Schädelnähte und der Mitbeteiligung anderer Knochen (Syndaktylie) ist eine klinisch-genetische Einteilung getroffen worden, die von einer Akrozephalosyndaktylie beim Apert-Syndrom über die intermediären Formen des Pfeiffer-Syndroms und des seltenen Jackson-Weiss-Syndroms bis zur kraniofazialen Synostose des Crouzon-Syndroms reicht. Neuerdings werden auch nicht-syndromale Kraniosynostosen mit einbezogen. Kürzlich konnten bei dieser Syndrom-Gruppe Mutationen in den Genen für Rezeptoren der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) als ursächliche Gendefekte nachgewiesen werden.

Bisher sind vier solche Rezeptoren (FGFRs) bekannt. Der extrazelluläre Anteil des Rezeptors setzt sich aus drei immunglobulin-ähnlichen Domänen zusammen, wobei die dritte Domäne hauptsächlich für die Ligandenbildung verantwortlich ist. Ihrer wichtigen Rolle in Entwicklungs- und Regenerationsprozessen - u.a. axiale Organisation in der embryonalen Entwicklung, Mesodermdifferenzierung, Keratinozytenorganisation und Gehirnentwicklung - werden sie durch gewebsspezifische Isomerenbildung (alternatives Spleißen) und promiske gewebspezifische Ligandbindung gerecht. Als Liganden kommen nicht nur die Fibroblastenwachstumsfaktoren - neun an der Zahl - in Frage, sondern auch Heparansulfat-Proteoglykane und Adhäsionsmoleküle von Neuralzellen. Offensichtlich existiert für jedes Gewebe ein feinabgestimmtes komplexes Signalnetzwerk.

Zusammen mit der Univ.-Klinik für Neurochirurgie (PD Dr. H. Collmann) und der Univ.-Kinderklinik konnten wir in einer grössere Gruppe von Patienten aus diesem Formenkreis die Gene für FGFR-1, -2 und-3 untersuchen. Es zeigte sich, dass einerseits identische Mutationen zu klinisch unterscheidbaren Syndromen führen können, andererseits Patienten mit einem ähnlichen Phänotyp Mutationen in unterschiedlichen Genen aufweisen können. Klinische und molekulare Klassifikation folgen also keinem gemeinsamen Schema. Lediglich die syndromalen Kraniosynostosen lassen sich von den nicht-syndromalen auch anhand ihrer Gendefekte abgrenzen (C29, C30). Diese Befunde lassen darauf schliessen, dass die Rezeptoren in einem gemeinsamen Signaltransduktionsweg zusammenwirken und in ihrer Funktion eng von einander abhängen.

Die Hämophilien A (HA) und B (HB) sind die klassischen Störungen der Blutgerinnung. Mit einer Inzidenz von 1 : 5000 männlichen Neugeborenen ist die HA die häufigste genetisch bedingte schwere Form der Blutungsneigung. Die Häufigkeit der HA ist bedingt durch ihre ungewöhnlich hohe Neumutationsrate (ca. 4 x 10^-5 ). Die HB ist dagegen mit einer Inzidenz von 1 : 25000 vergleichsweise selten. Aufgrund des X-chromosomal rezessiven Erbgangs erkranken in der Regel nur Jungen bzw. Männer, während Frauen klinisch unauffällige Überträgerinnen sein können. Die Störung der Blutgerinnung wird hervorgerufen durch die fehlende Aktivität der Gerinnungsfaktoren VIII (HA) bzw. IX (HB). Während sich die Defekte im Faktor-IX (FIX)-Gen bereits Ende der 80iger Jahre nahezu vollständig nachweisen ließen, entzog sich das Faktor-VIII (FVIII)-Gen aufgrund seiner Größe (186 kb, 26 Exons, 9 kb Transkript) lange Zeit einer Charakterisierung der kausalen genetischen Defekte. Diese sind außerordentlich variabel und umfassen das gesamte Spektrum der bisher beim Menschen bekannt gewordenen Mutationen. Eine besonders prävalente und FVIII-Gen spezifische Mutation, die sog. Intron 22-Inversion, ist seit 1993 bekannt. Alle anderen Mutationen sind jedoch sozusagen ,,privat" und familienspezifisch. Seit Anfang der 70er Jahre sind beide Hämophilieformen durch eine lebenslange Substitution der entsprechenden Gerinnungsfaktoren beherrschbar, so daß die hämophilie-typischen Gelenkverkrüppelungen vermeidbar sind. Nachdem die Gefahr der Übertragung von schwerwiegenden Virusinfektionen (Hepatitis, HIV) durch die Gerinnungskonzentrate gebannt ist, steht heutzutage die Hemmkörperbildung als schwerste Komplikation der Hämophilie-Therapie im Mittelpunkt der Forschungsbemühungen. Etwa 25 % der schwer betroffenen HA-Patienten entwickeln FVIII-Antikörper, welche zu einem Verlust der Wirksamkeit der FVIII-Konzentrate führen. Alternative Therapien sind weit weniger effektiv und extrem kostenintensiv.

Wir konnten in Zusammenarbeit mit einer Bonner Arbeitsgruppe zeigen, daß Mutationen der Typen Intron 22-Inversion, große Deletion und Stopmutation ein bis zu 10fach höheres Hemmkörperrisiko haben als Mutationen der Typen kleine Deletion und Missensemutation (C39). Des weiteren gelang es uns, durch Auswahl eines Patientenkollektivs mit einheitlicher Mutation (Intron-22-Inversion) die HLA-Merkmale DQB0602, DQA0102 und DR15 mit der Hemmkörperbildung zu korrelieren (C40).

Durch Untersuchung eines anderen, genau definierten Kollektivs von 147 Patienten mit schwerer HA waren wir in der Lage, die anteilige Zusammensetzung der verschiedenen Mutationstypen für die schwere HA (37 % Intron 22-Inversion, 14 % Stopmutation, 18 % Missensemutation, 12 % kleine Deletion, 6 % große Deletion, 13 % nicht identifiziert) zu bestimmen (C41). Die Untersuchung weiterer Familienmitglieder zeigte, daß die HA etwa 5 mal häufiger in männlichen als in weiblichen Keimzellen entsteht, wobei es mutationsspezifische Unterschiede gibt. So entstanden die vergleichsweise seltenen Deletionen häufiger in weiblichen Keimzellen (C41).

Bei drei Patienten mit einer ungewöhnlichen Blutungsneigung im Rahmen einer Thromboembolieprophylaxe mit dem Medikament Marcumar fanden wir eine marcumar-induzierte schwere HB als bisher unbekannte Blutungsursache (C42). In Abwesenheit von Marcumar wiesen alle drei Patienten völlig unauffällige Gerinnungsparameter auf. Die molekulargenetische Untersuchung ergab bei allen drei Patienten eine Mutation im Exon 2 des FIX-Gens, in der das FIX-Propeptid codierenden Sequenz (Aminosäureposition Ala-10) (C43).

Aufgrund der hohen Neumutationsrate im FVIII-Gen und der häufig verstorbenen Indexpatienten in den Hämophiliefamilien, läßt sich in vielen Familien eine sichere Überträgerdiagnose nur durch direkte Charakterisierung des Gendefektes erstellen. Hier sind wir zur Zeit das einzige Labor in Deutschland, daß ein komplettes Screening des FVIII-Gens für die Diagnosefindung anbietet.

Die gegenwärtigen und zukünftigen Arbeitsschwerpunkte betreffen neben der Routinediagnostik die weitere Untersuchung der Hemmkörperpathogenese sowie die Mechanismen der Mutationsentstehung.

In der Arbeitsgruppe werden im wesentlichen zwei Forschungsschwerpunkte bearbeitet. Der Schwerpunkt "Analyse von hereditären Makuladegenerationen" hat die Aufklärung der molekularen Grundlagen diverser Erkrankungen der zentralen Netzhaut zum Ziel. Im Schwerpunkt "Analyse des familiären Brust- und Ovarialkarzinoms" werden die molekularen Ursachen der genetischen Disposition zum Brust- bzw Ovarialkrebs untersucht.

Die hereditären Makuladegenerationen stellen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen des zentralen Netzhautbereiches dar und zählen zu den häufigsten Ursachen für Blindheit in den westlichen Industrienationen. Die molekulare Basis der degenerativen Veränderungen der zentralen Netzhaut sind jedoch weitgehend unbekannt. Mit der Isolierung und Charakterisierung von Genen, die in der Pathogenese der verschiedenen Makuladegenerationen eine grundlegende Rolle spielen, soll ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Pathologie dieser Erkrankungen geleistet werden, um damit die Grundlagen für die Entwicklung präventiver Therapien zu schaffen.

Die Bestsche vitelliforme Makuladegeneration (Bestsche Krankheit) ist eine autosomal dominante Augenerkrankung mit juvenilem Beginn. Sie ist typischerweise durch eine eidotter-artige Ansammlung von gelblichem Material im makulären Bereich des retinalen Pigmentepithels gekennzeichnet (Abb. 5). Das zentrale Sehen bleibt in den meisten Fällen bis in die mittleren Lebensjahre erhalten, kann jedoch aufgrund disziformer Veränderungen in höherem Alter stark beeinträchtigt werden.

Der Genort der Bestschen Krankheit wurde mittels genetischer Kopplungsanalyse auf Chromosom 11q12-q13.1 in einen etwa 1.4 Megabasen (Mb) großen Bereich zwischen D11S1765 und UGB (Uteroglobin) kartiert. Wir haben diese Region in überlappenden YACs (yeast artificial chromosomes) und PACs (P1 artificial chromosomes) isoliert, um mit verschiedenen molekulargenetischen Methoden eine vollständige Genkarte des Intervalls aufstellen zu können. Eine umfassende Charakterisierung dieser Gene wird eine wichtige Voraussetzung schaffen, um mögliche Kandidaten für das Bestsche Krankheitsgen zu selektionieren und schließlich das Krankheitsgen selbst zu identifizieren.

Die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS) ist eine vitreoretinale Degeneration, die nur männliche Personen betrifft. In den meisten Fällen ist die auffälligste Veränderung im makulären Bereich als feine speichenartige Läsionen zu erkennen (Abb. 6). Eine foveale Schisis auf der Ebene der Ganglienzellschicht der sensorischen Netzhaut entwickelt sich häufig in juvenilem Alter und führt bei den betroffenen Männern zu einem stark eingeschränkten Sehvermögen. Möglicherweise läßt sich die Ursache der RS auf einen Defekt in den Gliazellen der Netzhaut zurückführen.

Der RS Genlocus kartiert auf Chromosom Xp22.2 innerhalb einer etwa 900 Kilobasen (kb) großen Region, die von den DNA Loci DXS418 und DXS999 flankiert wird. Zur verfeinerten molekulargenetischen Analyse wurde die genomische Region in überlappenden PAC Klonen isoliert (Abb. 7). Um das RS Gen zu identifizieren, werden zur Zeit mehrere Methoden angewendet, die die Identifizierung aller Gene der Kandidatenregion zum Ziel haben, wie z. B. die Exon Trapping Technik, die cDNA Selektion, sowie computergestützte Analysen von Gen-Datenbanken. Das Auffinden von Transkripten mit Hilfe von dbEst (expressed sequence tag-Datenbanken) Analysen bzw hypothetischen Exonvorhersagen basierend auf GRAIL Algorithmen, wurde durch das Vorliegen der kompletten genomischen Sequenz des 900 kb Kandidatenintervalls möglich (Sequenzierung wird im Sanger Institut, Cambridge, UK, durchgeführt). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt konnten wir 39 potentielle Gene identifizieren. Diese Gene werden im Detail analysiert und mögliche Kandidaten für das RS Gen detaillierten Mutationsanalysen unterzogen.

Die North Carolina Makuladystrophie (NCMD) ist eine normalerweise nicht progressiv verlaufende autosomal dominante Erkrankung der zentralen Retina. Die Krankheit ist durch das Auftreten kleiner gelblicher Drusen gekennzeichnet, die zum Teil eine konfluente Erscheinung annehmen und von disziformen Läsionen oder dem Auftreten von neovaskulären Membranen begleitet sein können (Abb. 8). Schwere Fälle von NCMD präsentieren sich mit makulären Colobomata. Im allgemeinen tritt die Krankheit im Kindesalter auf.

Der Genort für die NCMD wurde auf Chromosom 6q14-q16.2 in einen mehr als 7 cM großen Interval kartiert. In einer größeren Kopplungsstudie, die in unserem Labor durchgeführt wurde, gelang es diese Region auf etwa 2 cM zu begrenzen. Damit ist das NCMD Gen positionellen Klonierungsansätzen zugänglich. Methoden, die bereits für die Isolierung der Krankheitsgene "Bestsche Krankheit" und "X-gebundene juvenile Retinoschisis" angewandt werden, sollen auch für die molekulare Charakterisierung des NCMD Gens zum Einsatz kommen.

Die Sorsbysche Fundus Dystrophie (SFD) ist eine seltene, autosomal dominante Makuladegeneration mit einem späten Beginn der Symptome in der vierten Lebensdekade. Die Erkrankung ist durch den Verlust des zentralen Sehens als Folge subretinaler Neovaskularisationen und disziformer Degenerationen gekennzeichnet (Abb. 9). Genetische Kopplungsanalysen in einer großen kanadischen SFD Familie haben den Genort auf Chromosom 22q13-qter lokalisiert. Die Analyse von Kandidatengenen aus diesem Bereich konnte schließlich den Gewebsinhibitor der Metalloproteinasen-3 (TIMP3) als das Krankheitsgen, das die SFD verursacht, identifizieren.

Umgestaltungen der extrazellulären Matrix (ECM) stellen komplexe Prozesse dar, die für eine normale Entwicklung vielzelliger Mechanismen von entscheidender Bedeutung sind. Störungen in der ECM Homöostase sollten zu einer pathologischen Degradation der ECM Komponenten führen und könnten eine wichtige Rolle bei genetisch komplexen Erkrankungen, wie z.B. Arthritis, oder bei der Metastasierung von Krebszellen, spielen. Die Gewebsinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMPs) sind natürlich vorkommende Inhibitoren der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), wobei die MMPs eine große Gruppe von Enzymen darstellt, die zusammen alle Komponenten der ECM degradieren können. Bisher konnten 4 Mitglieder der TIMP Genfamilie identifiziert werden.

Ausgedehnte Mutationsanalysen in Familien mit SFD haben gezeigt, daß ein charakteristischer Typus von Aminosäureveränderungen im TIMP3 Gen der Krankheit zugrunde liegt. In allen Fällen führen die unterschiedlichen Mutationen zu einem Aminosäureaustausch im C-terminalen Ende des Proteins, der einen zusätzlichen Cysteinrest zu den bereits vorhandenen 12 Cysteinen des Peptids einführt (Abb. 10). Um die Frage nach der molekularen Pathologie der SFD zu klären, werden verschiedene molekulargenetische und biochemische Ansätze verfolgt. Unter anderem sollen mit Hilfe des Hefe Zwei-Hybrid Systems interagierende Proteine des normalen und mutanten TIMP3 gefunden werden. Darüberhinaus sollen Mausmodelle mit gezielten Veränderungen in der Struktur des Maus Timp3 Gens erzeugt werden. Knock-out Konstrukte, die die kodierende Region des Gens teilweise deletieren und in-frame ein LacZ Reporter-Gen einführen, wurden bereits hergestellt und sollen es ermöglichen, die Funktion des Timp3 Gens während der Mausentwicklung zu untersuchen. Darüberhinaus wurden sogenannte knock-in Konstrukte hergestellt, die beim Menschen bekannte SFD Mutationen nachahmen und die mit Hilfe des Cre/LoxP Systems äquivalente Punktmutationen im Maus Timp3 Gen einführen.

Die Stargardtsche Krankheit, auch bekannt als Fundus flavimaculatus, ist die häufigste hereditäre, autosomal rezessive Makuladystrophie (Inzidenz etwa 1:10.000). Sie ist durch einen juvenilen Beginn, zentrale Sehstörungen, progressive bilaterale Atrophie des makulären retinalen Pigmentepithels und des Neuroepithels gekennzeichnet. Häufig treten gelbliche "Flecken" im äquatorialen Fundus und/oder um die Makula herum auf (Abb. 11).

Vor kurzem wurde ein neues Mitglied der Superfamilie der ATP-bindenden (ABC) Transporter charakterisiert und gezeigt, daß dieses retina-spezifische Protein (ABCR, für ATP-binding cassette transporter, retina) in Patienten mit der Stargardtschen Krankheit mutiert ist. Die ABC Superfamilie zeichnet sich typischerweise durch 4 Domänen aus, wobei 2 konservierte ATP-bindende Bereiche und 2 multiple Transmembran-Domänen unterschieden werden (Abb. 12). Eine Reihe menschlicher Erkrankungen werden durch Mutationen in weiteren Mitgliedern dieser Superfamilie verursacht, z.B. die zystische Fibrose (CFTR), X-gebundene Adrenoleukodystrophie (ALD), persistierende hyperinsulinämische Hypoglykämie der Kindheit (SUR), Zellweger Syndrom (PMP70), HLA Klasse I Defizienz (TAP+2).

Mutationsanalysen im 2273 Aminosäuren großen ABCR Gen haben bisher 23 krankheitsverursachende Veränderungen bei Patienten mit der Stargardtschen Erkrankung gefunden (Abb. 12). Mehr als die Hälfte aller Mutationen ereignen sich in den ATP-bindenden Kassetten. Die genaue Transportfunktion des Proteins in der Retina ist bisher nicht bekannt. Die Lokalisation des ABC Transporters in den Außensegmenten der Stäbchen Photorezeptoren läßt jedoch vermuten, daß es in den bidirektionalen Transport von Metaboliten, Lipiden oder Peptiden in bzw aus der Außensegmentmembran der Stäbchen involviert ist. Defekte in der Funktion des Transporters könnten somit zu einer Akkumulation bzw Defizienz eines Substrates und schließlich zum Zelltod und damit einer Dysfunktion der Photorezeptoren führen.

Brustkrebs ist in unserer Bevölkerung die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Man geht davon aus, daß etwa jede 10. Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs erkrankt. In Deutschland wird jedes Jahr bei etwa 46.000 Frauen eine Brustkrebserkrankung festgestellt. Man schätzt, daß etwa 5% aller Brustkrebserkrankungen auf der Grundlage einer ererbten Veranlagung entstehen, d.h. daß etwa 2.300 dieser 46.000 Frauen aufgrund einer familiären Disposition an Brustkrebs erkranken. Die erbliche Disposition für Brust- und/oder Eierstockkrebs beruht in vielen Familien auf Veränderungen in autosomal dominant vererbten Tumorsuppressorgenen, die zum Teil mit sehr unterschiedlicher Penetranz und daher einem individuellen Tumorrisiko assoziiert sind.

D7a) Molekulargenetische Untersuchungen in den Tumorsuppressorgenen BRCA1 und BRCA2

Im Rahmen eines Schwerpunktprogramms der Deutschen Krebshilfe wurde eine multizentrische Studie ,,Familiärer Brust- und Eierstockkrebs", an der 10 universitäre Zentren in Deutschland teilnehmen, ins Leben gerufen. Dieses hat zum Ziel, Aufschlüsse über die Entstehung erblicher Krebsformen zu gewinnen und verbesserte Methoden für die Vorbeugung, die Früherkennung und die Behandlung der Betroffenen und der nicht-betroffenen Genträger zu entwickeln. Im "Familiären Brustkrebszentrum Würzburg" werden zur Zeit etwa 180 Patienten auf Mutationen in einem der beiden Brustkrebsgene BRCA1 und BRCA2 untersucht. Da diese beiden hoch-penetranten Tumorsuppressorgene eine relativ komplexe genomische Struktur aufweisen, kommen für die Analysen verschiedene Methoden der Mutationsentdeckung zum Einsatz, unter anderem der Protein Trunkationstest, SSCA (single stranded conformational analysis) und das direkte Sequenzieren PCR-amplifizierter Exone. Bisher wurden 7 prädisponierende Keimbahnmutationen im BRCA1 und weitere 6 Mutationen im BRCA2 identifiziert. All diese Mutationen haben eine Leserasterverschiebung zur Folge bzw stellen Unsinns-Mutationen dar und sollten daher ein funktionelles Null-Allel darstellen.

Trägerinnen einer disponierenden Veränderung im BRCA1 haben ein etwa 70-80%iges lebenslanges Risiko ein Brust- und ein etwa 60%iges Risiko ein Ovarialkarzinom zu entwickeln. BRCA2 Keimbahnmutationen vermitteln ein dem BRCA1 vergleichbares Risiko für Brustkrebs, jedoch ein deutlich geringeres Risiko für Ovarialkrebs. Zusätzlich sind BRCA2 Mutationen mit dem Auftreten von männlichem Brustkrebs assoziiert.

Den Risikopersonen aus den Brustkrebsfamilien mit bekannter Disposition im BRCA1 oder BRCA2 wird in unserem Zentrum eine prädiktive DNA Diagnostik angeboten. Mehrere Personen haben sich bereits zu einer solchen Untersuchung entschlossen und befinden sich zur Zeit in den verschiedenen Stadien des Beratungs- und Testungsprogramms.

D7b) Bevölkerungsbezogene molekulargenetische Studie zur Abschätzung des Brustkrebsrisikos bei weiblichen Trägerinnen des AT-Gens

Während Keimbahndispositionen im BRCA1 und BRCA2 einen Anteil von nur etwa 2% aller Brustkrebserkrankungen erklären können, sollten weitere disponierende Gene mit geringerer Penetranz und daher unauffälliger Familienanamnese für einen weit größeren Teil der Brustkrebserkrankungen verantwortlich sein. Ein solcher Kandidat ist das ATM (Ataxia Telangiectasia, Mutated) Gen.

Ataxia Telangiectasia (AT) ist eine autosomal rezessive Erkrankung, die cerebelläre Degeneration, immunologische Defekte und Krebsdisposition einschließt und durch Mutationen im ATM Gen verursacht wird. Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß heterozygote Trägerinnen des ATM Gens ein etwa 3-5 fach höheres Risiko tragen, an Brustkrebs zu erkranken. Basierend auf einer geschätzten Heterozygotenfrequenz von etwa 1% in der Bevölkerung läßt sich errechnen, daß möglicherweise fast 5% aller Brustkrebserkrankungen auf eine erbliche Disposition im ATM Gen zurückgeführt werden könnten.

Unser Projekt hat zum Ziel, in einer bevölkerungsbezogenen Studie eine exakte Abschätzung des Brustkrebsrisikos für ATM Genträger zu ermitteln. Dabei wird das Mutationsprofil des ATM Gens in einer zufällig ausgewählten Gruppe von etwa 1000 Brustkrebspatientinnen mit einer gesunden Kontrollgruppe von ebenfalls etwa 1000 weiblichen Personen verglichen. Diese Analysen sollen genaue Daten über die Genfrequenz des ATM Gens in der Normalbevölkerung geben und damit zu einer Abschätzung des Brustkrebsrisikos bei Genträgerinnen führen.

Neuroaxonale Dystrophien sind schwerwiegende Erkrankungen des Kindesalters. Als mögliche Ursache wurde bei einigen Kindern eine Defizienz des Enzyms Azetylgalaktosaminidase gezeigt. Somit handelt es sich bei den neuroaxonalen Dystrophien zumindest in einem Teil der Fälle um eine lysosomale Stoffwechselerkrankung.

Kooperationen
Desnick RJ, Mt. Sinai Hospital, New YorkConzelmann E, Theodor-Boveri-Institut, Würzburg

Zellen von Patienten mit Ataxia teleangiectasia und Nijmegen breakage Syndrom zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung und dienen daher als Modellsysteme für den Zusammenhang zwischen Strahlenempfindlichkeit und erhöhtem Neoplasie-Risiko. Im Rahmen eines überregionalen Konsortiums beteiligen wir uns an der Mutationsanalyse im ATM-Gen und suchen nach ATM-Mutationen bei Tumorpatienten, welche bei therapeutischer Bestrahlung erhöhte Sensitivität zeigen. Mit zellbiologischen Experimenten erfolgt die Zuordnung der Strahlensensitivität zu definierten Abschnitten des Zellzyklus. Aufgrund der hohen Zahl von "privaten" Mutationen im ATM bleibt die von uns entwickelte Zellzyklusanalyse-Methode der Wahl zur Differentialdiagnostik des AT-Formenkreises.

Kooperationen
Gross HJ, Institut für Biochemie, Würzburg
Kubbies M, Fa. Boehringer Mannheim, Penzberg
Flentje M, Klinik für Strahlentherapie, Würzburg
Seemanová E, Karls-Universität, Prag
Rosenthal A, IMB, Jena
Tommerup N, J.F. Kennedy Institut, Glostrup (Dänemark)

Frau Schroeder-Kurth ist Mitglied der zentralen Ethikkommission der Bundesärztekammer, Köln, sowie Mitglied des Ethischen Beirates des Bundesministeriums für Gesundheit, Bonn. Als Entdeckerin des ersten menschlichen Chromosomenbruchsyndroms gilt ihr Interesse weiterhin der Fanconi Anämie Forschung (F2, F8, F12). Als Gastprofessorin am Institut für Humangenetik befaßt sie sich vor allem mit ethischen Fragen in der medizinischen Genetik. In jüngster Zeit wurden u.a. Analysen und Stellungnahmen zu folgenden Themenbereichen erarbeitet: Selbstbestimmung und Manipulation in der medizinischen Genetik (F10), Präimplantationsdiagnostik (F11), sowie ethische Fragen im Zusammenhang mit der Gentherapie (F14). Frau Schroeder-Kurth gehört überdies der Senatskommission der DFG für Grundsatzfragen der Gentechnik an.