Methoden: Patch-clamp, Double-electrode Voltage-clamp (DEVC), Double-barrelled Micrelectrodes, Ionensensitive Elektroden, Heterologe Expressionssysteme, Zellkultur, Site-directed Mutagenese, Gaswechsel, Chlorophyll Mikrofluorometrie, Laserscan-Spektroskopie

Stomata stellen lebenswichtige Organe der höheren Pflanzen dar, da sie die CO₂-Versorgung für die Photosynthese sicherstellen (Abb. 1). Durch die offenen Poren verdunstet jedoch gleichzeitig Wasser, so dass die Öffnungsweite der Stomata einer strengen Kontrolle durch endogene Signale und Umweltfaktoren unterworfen ist. Hierzu zählen Lichtqualität und -quantität, die CO₂-Konzentration sowie die Phytohormone Auxin und Abszisinsäure. Die Öffnung der Stomata wird durch eine reversible Volumenzunahme in den beiden Schließzellen ermöglicht. Die Grundlage hierfür stellt die Akkumulation von Kaliumsalzen zunächst im Cytosol und schließlich in der Vakuole dar, die dann den Wassereinstrom und damit die Volumen- und Turgorzunahme der Zelle treibt, so dass eine zentrale Pore geöffnet wird. Die Kalium-Aufnahme wird durch Chlorid-Ionen und die Malat-Synthese elektrisch neutralisiert. Während die Stomata im Licht und in niedrigen CO₂-Konzentrationen öffnen, löst das Trockenstress-Hormon Abszisinsäure sowie hohe CO₂-Konzentrationen den Stomaschluss aus. Wir haben die Mechanismen des Ionentransports und der Signaltransduktion der Schließzelle durch die Kombination von physiologischen, molekularbiologischen und biophysikalischen Methoden untersucht.

Um Signal-gesteuerte Antworten der Schließzellen nicht-invasiv studieren zu können, wurden ionensensitive Elektroden durch die geöffneten Stomata in den apoplastischen Raum eingeführt (Zusammenarbeit mit Hubert Felle, Giessen) (Abb. 2A). Nach einem künstlich erzeugten Reiz, wie der Änderung der Lichtbedingungen, der CO₂-Konzentration oder des Hormonspiegels, wurden die K⁺-, Cl^-- und H⁺-Konzentrationen im Apoplasten verfolgt. Unter Bedingungen, die Stomaöffnung begünstigen, sanken die K⁺- und Cl^--Konzentrationen sowie der pH-Wert der schließzellnahen Zellwände. Die elektrischen Ereignisse an der Plasmamembran der intakten Pflanze wurden durch Zweikanal-Mikroelektroden aufgezeichnet, die für Strom- und Spannungsklemmen-Messungen geeignet sind (Abb. 2B). Ausgehend von einer schwach negativen Membranspannung im Dunkeln nahm dieser Potentialgradient durch einen anhaltenden Lichtreiz stark zu (Abb. 3). Diese stark negativen Spannungen, die die Aufnahme von K⁺-Ionen aus dem Apoplasten ermöglichen, werden durch die Aktivität der H⁺-ATPase generiert. Bei schwach negativen Membranspannungen, die im Dunkeln beobachtet werden, dominiert der K⁺-Efflux (Abb. 3). Im Einklang mit den Ergebnissen der ionenselektiven Elektroden verliert die Zelle Chlorid, aber auch Malat durch Anionenkanäle [1], so dass die Potentialdifferenz wieder abgebaut wird.

Die lichtgesteuerte H⁺-ATPase benötigt für den Aufbau der Membranspannung und die Ansäuerung des Apoplasten eine stetige Energiezufuhr. Dieser Prozess könnte durch die ATP-Produktion der Schließzell-Photosynthese genährt werden. Die photosynthetische Kapazität der Schließzellen, die nur über 5-15 Chloroplasten verfügen, ist jedoch nur wenig untersucht. Aus diesem Grund wurde eine neues Mikrofluorometer entwickelt, mit dessen Hilfe wir die photosynthetische Leistung einzelner Schließzellen quantifizieren konnten [2]. So wurde gezeigt, dass der Elektronentransport in Schließ- und Mesophyllzellen dem gleichen Prinzip folgt. In einem weiteren Schritt haben wir diese Technik mit Patch-Clamp-Messungen kombiniert, um die Interaktion der Chloroplastentätigkeit und des Ionentransports der Schließzell-Plasmamembran zu studieren. Dabei wurde cytoplasmatisches ATP als Signalsubstanz identifiziert, das sowohl für die K⁺-Kanalaktivität [3] als auch den Elektronentransport verantwortlich zeichnet und damit die Aktivität beider Membransysteme verbindet.

Kalium-Kanäle erlauben einen Ionentransport nur entlang des elektrochemischen Gradienten. Da cytoplasmatisch eine K⁺-Konzentration von ca. 100 mM aufrecht erhalten wird, kann dieser Makronährstoff aus dem verdünnten apoplastischen Medium nur bei sehr negativen Membranpotentialen aufgenommen werden, die Werte negativ von -180 mV annehmen können. Die K⁺-Aufnahmekanäle der Schließzelle sind an diese Bedingungen angepasst und öffnen bei der Membranhyperpolarisation, typischerweise bei Werten negativ von ca. -100 mV. Wir konnten zeigen, dass diese Kanäle mit einem Sensor ausgestattet sind, der nicht vom K⁺-Gradienten, sondern nur vom Potentialgradienten über der Membran abhängt [4]. Für die Schließzelle bedeutet dies jedoch, dass bei Membranspannungen negativ von der Öffnungsschwelle, aber positiv vom Nernst-Potential für K⁺, die Kationen passiv aus der Zelle entlassen werden und somit der Konzentrationsgradient nur mit zusätzlichem Energieaufwand aufrecht erhalten werden kann.

Die Kaliumaufnahme ist jedoch nicht nur über das Membranpotential an die Aktivität der H⁺-ATPase gekoppelt. Die von diesem Elektroenzym ausgeschleusten Protonen können an das K⁺-Kanalprotein binden und so dessen Öffnung erleichtern. Indem die Spannungsabhängigkeit des Kanals zu positiveren Membranpotentialen verschoben wird, unterstützt eine apoplastische Ansäuerung während der Stomaöffnung die Kaliumaufnahme [5]. Nach der Klonierung und funktionellen Expression des Schließzell-K⁺-Einwärtsgleichrichters KST1 aus Solanum tuberosum [3] stand der Weg für die Identifizierung des pH-Sensors offen. Mit Hilfe der gerichteten Mutagenese konnten zwei extrazellulär exponierte Histidine für die pH-Sensitivität von KST1 verantwortlich gemacht werden [6]; [7]. Der Austausch beider Histidine gegen ungeladene Alanine resultierte in einer KST1-Mutante, die nicht mehr auf pH-Änderungen regierte. Während das Histidin im Linker zwischen dem dritten und vierten transmembranen Segment der anzunehmenden Kanalstruktur (Abb.4) KST1-spezifisch vorkommt, ist das in der Porenregion (GYGDxH) lokalisierte Histidin und damit die Säureaktivierung in den pflanzlichen gegenüber den tierischen Vertretern konserviert. Die pH-Sensitivität weist jedoch auch unter den Schließzell-Kanälen verschiedener Herkunft (Nicotiana, Solanum, Vicia, Arabidopsis) speziesabhängige Unterschiede auf [5]. Im Vergleich mit S. tuberosum, benötigen die K⁺-Kanäle aus Arabidopsis höhere Protonenkonzentrationen im Apoplasten [8]. Dieser Unterschied konnte auch auf molekularer Ebene nachvollzogen werden. Durch Mutationen in den Porenregionen der entsprechenden klonierten Kanäle KST1 und KAT1 konnte die pH-Sensitivität von KST1 neben den Histidinen auf ein benachbartes Asparagin zurückgeführt werden [9]. Dagegen scheint die Ausprägung der Säureaktivierung in KAT1 die Beteiligung zusätzlicher Aminosäuren zu erfordern.

Neben pH-Schwankungen im Apoplasten, wurde auch ein Anstieg der cytoplasmatischen Protonenkonzentration als früher Schritt bei der Auxin-abhängigen Stomaöffnung beobachtet. Der für K⁺-Kanäle postulierte cytoplasmatische pH-Sensor wurde in einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Toshinori Hoshi (Iowa, USA) aufgeklärt. Für die Säure-induzierte Aktivitätssteigerung, die sich in einer schnelleren Öffnungskinetik ausdrückt, ist das cytoplasmatisch orientierte Histinin 118 im Linker zwischen S2 und S3 (Abb. 4) in KAT1 verantwortlich [10]. Während Substitutionen an dieser Position zu positiven Aminosäuren den protonierten Zustand simulierten, führten negative geladene Reste zu einer Verlangsamung der Aktivierungskinetik und kommen damit dem deprotonierten Zustand des Kanalproteins gleich.

Aufgrund vieler Mutagenesestudien hat sich KAT1 zum Modellkanal für das Studium des pflanzlichen Ionentransports entwickelt (Abb. 4, Übersicht in Hoth et al. 1997b). Neben dem externen pH-Sensor konnte die Porenregion als funktionelle Domäne charakterisiert werden, die die Selektivität und Blockierbarkeit durch Cs⁺ und Ca²⁺ vermittelt [11]; [12].

Nachdem bis heute mehr als 15 pflanzliche K⁺-Kanäle kloniert wurden, die zu der Klasse der 6-Transmembrankanäle zählen, können diese Vertreter aufgrund ihres Verwandtschaftsgrades mindestens 5 Unterfamilien zugeordnet werden [13]. Dabei gruppieren die Schließzell-Kanäle KST1 und KAT1 in eine Unterfamilie. Auch für die Mitglieder anderer Unterfamilien werden ihre Expressionsmuster erstellt und ihre Regulation und physiologische Bedeutung untersucht. Dabei stellt sich die Frage, ob in einem Zelltyp nur ein Kanal exprimiert, oder ob die funktionellen Schließzellkanäle aus der heteromeren Zusammenlagerung verschiedener alpha-Untereinheiten entstehen, wie die beobachteten Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften der Kanäle in ihrer nativen Membran und der klonierten Vertreter in der Oocytenmembran vermuten lassen [8]. Wurden z.B. cRNAs von KST1 (exprimiert in der Schließzelle) und SKT1 (unbekannte Lokalisation) oder KAT1 (exprimiert in der Schließzelle) und AKT1 (exprimiert hauptsächlich in der Wurzel) in die Oocyte koinjiziert, so bildeten sich im in vitro-System funktionelle Heteromere aus, was die zweite These stützt [14].

Um zu entscheiden, ob kat1 tatsächlich die molekulare Grundlage für den funktionellen Schließzellenkanal darstellt, haben wir eine KAT1-Verlustmutante hergestellt. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Klaus Palme (Max-Delbrück-Laboratorium Köln) wurde KAT1::En-1 aus einer En-mutagenisierten Arabidopsis-Population isoliert. Patch-clamp-Untersuchungen, Gaswechselanalysen und die Messung apoplastischer K⁺-Gehalte mittels ionensensitiver Elektroden wurden nun genutzt, um die physiologische Bedeutung von KAT1 anhand des KAT1::En1-Phänotyps herauszuarbeiten.

Seit der Klonierung des ersten pflanzlichen K⁺-Kanals - des Schließzellenkanals KAT1 aus Arabidopsis thaliana 1992 - schreitet das Verständnis des pflanzlichen Ionentransports und der Regulation der Stomabewegung stetig voran (Übersicht in [13]). In Zusammenarbeit mit dem Institut für den Wissenschaftlichen Film (IWF Göttingen) haben wir einen Lehrfilm in drei Teilen gedreht, der anhand des Beispiels "K⁺-Kanal der Schließzelle" die modernen Techniken illustriert, die die Wissenschaften maßgeblich beeinflussen (http://www.iwf.de/iwfger/alldaten/c2014.html). "Vom Phänomen zum Molekül" beginnt bei der Beobachtung eines Phänomens (Stomabewegung), verfolgt es bis zu seinen molekularen Bausteinen (K⁺-Kanäle), zeigt die Klonierung eines K⁺-Kanals und endet mit dessen Kristallisation.

Ein wenig verstandenes Phänomen der Pflanzenphysiologie ist die Interaktion der Organe, die Assimilate erzeugen mit denen, die sie verbrauchen oder speichern. Höhere Pflanzen müssen die Aufgabe bewältigen, den Transport der Photosyntheseprodukte über lange Strecken zu den verschiedenen Orten des Verbrauchs (Wurzeln und Früchte) zu koordinieren. Der Mechanismus der optimalen Verteilung der Assimilate entscheidet im Verlauf einer Wachstumsperiode über die Quantität und Qualität der Ernteerträge. Der osmotische Gradient im Leitbündelsystems zwischen den Orten der Synthese und den Orten des Verbrauchs, bestimmt die Richtung und Geschwindigkeit des Assimilattransports im Phloem der Pflanze. Neben Saccharose stellen Kaliumsalze das Hauptosmotikum des Phloemsaftes da. In diesem Zusammenhang wurde nachgewiesen, dass eine optimale Versorgung der Pflanze mit Kalium die Beladung des Phloems mit Zuckern und deren Translokation über längere Strecken fördert. Kaliums könnte in diesem Zusammenhang den Protonenefflux kompensieren, der den Eintransport des Zuckers in die Siebröhre begleitet. Neben gelösten Stoffen werden Informationen in Form von elektrischen Signalen über das Netzwerk des Phloems in der Pflanze verbreitet. Diese sogenannten Aktionspotentiale, die sich schnell entlang der Plasmamembran der Siebröhre ausbreiten, werden durch zeit- und spannungsabhängige Aktivitätsänderungen verschiedener Ionenkanäle erzeugt. Da das Membranpotential des Siebröhren-/Geleitzellenkomplexes von Kalium dominiert ist, untersuchen wir Kaliumkanäle, die im Phloem lokalisiert sind und dort an der Beladung oder Entladung von Assimilaten beteiligt sind. In diesem Zusammenhang stellen wir drei Kaliumkanalisoformen aus Arabidopsis thaliana, Vicia faba und Zea mays vor.

In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana haben wir einen Kaliumkanal im Leitbündelsystem identifiziert. Mit Hilfe von in situ Hybridisierungstechniken ("whole mount") und transgenen Pflanzen, die beta-Glucuronidase unter Kontrolle des K⁺-Kanalpromoters synthetisieren, konnten wir zeigen, dass die mRNA im Phloem und Xylemparenchym aller grünen Pflanzenteile lokalisiert ist (siehe Abb. 5). Weitere Untersuchungen anhand von Northern Blot Experimenten belegten, dass Licht ein Signal für die Kanalgenregulation sein muss. Im Tagesverlauf erreicht die mRNA-Konzentration des Kanals in den Blättern nach 3-stündiger Belichtung (11:00 Uhr) den höchsten Wert und fällt kontinuierlich bei weiterer Belichtung (16:00 Uhr) ab. Während der 16-stündigen Dunkelperiode (16:00 nachmittags bis 8:00 Uhr morgens) sinkt die Transkriptmenge auf den niedrigsten Wert (siehe Abb. 6). Da Licht für die Pflanze auch Photosynthese bedeutet, haben wir die beiden möglichen Gen-induzierenden Signale Licht und Photosynthese getrennt untersucht. Hierbei konnten wir zeigen, dass bei Inkubation von Blättern in CO₂-freier Luft sowohl nach 3 Std. im Licht als auch im Dunkeln die Aktivierung des Kanalgens ausbleibt. Die Kontrollpflanzen nach 3 Std. in CO₂-haltiger Luft hingegen enthielten die maximale mRNA-Konzentration des K⁺-Kanals (siehe Abb. 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass für die Geninduktion dieses im Leitbündel lokalisierten K⁺-Kanaltyps nicht nur Licht sondern auch Photosynthese notwendig ist. Während der Entwicklung, wird die maximale Transkriptionsaktivität des K⁺-Kanalgens in der Blütenstandachse, zum Zeitpunkt der Blüte und Samenreife erreicht. Die mRNA-Konzentration in diesem Organ steigt graduell von der Spitze bis zur Rosette Licht-abhängig an. Diese Beobachtung unterstützt die Annahme, dass die Produkte der Photosynthese, die von den Orten der Synthese in den grünen Blättern der Rosette zu den Orten des Verbrauchs, den Blüten und Samen, umverteilt werden müssen, ein Signal für die Induktion des Phloemkanals darstellen [15]. Die elektrophysiologischen Eigenschaften des heterolog in Xenopus Oocyten exprimierten Proteins unterscheiden sich von den der Schließzellkanäle (KAT1, KST1) und von dem Koleoptilenkanal (ZMK1). Der K⁺-Kanal des Leitbündels wird durch apoplastische Protonen und physiologische Ca²⁺-Konzentrationen geblockt [16]. Da eine Ansäuerung der Zellwand zur Freisetzung von Ca²⁺ führt, ist eine Regulation dieses Kanaltyps durch diese apoplastischen Faktoren denkbar. Zur Aufklärung der Rolle dieses Ionenkanals für die Physiologie des Phloems haben wir eine "Knock-out" Mutante in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von M. Bennett, Nottingham, UK isoliert. Aus einer Population von 7000 Arabidopsis Mutanten wurde mit Hilfe der "reversen Genetik" eine identifiziert, die eine T-DNA-Insertion im Phloemkanalgen aufwies. Diese Insertion hatte zur Folge, dass die Synthese der Kanal-mRNA ausblieb (siehe Abb. 8). Von der Untersuchung dieser Kanalmutante erhoffen wir uns Hinweise auf die Beteiligung dieses K⁺-Kanaltyps für die Verteilung von Assimilaten und die Ausbreitung elektrischer Signale im Phloem von Arabidopsis.

Auf der Suche nach einem K⁺ Kanalgen des Phloems von Vicia faba haben wir zunächst ein RT-PCR-Fragment aus Blatt-mRNA amplifiziert, um diese homologe Sonde zum Durchmustern einer Keimblatt cDNA-Bank (sink) einzusetzen. Hierbei isolierten wir den K⁺-Kanal VFK1. Anhand von Northern Experimenten konnten wir zeigen, dass VFK1 in den oberirdischen Organen exprimiert wird und lokalisierten ihn, wie in Abb. 9 gezeigt mittels in situ Hybridisierung und in situ RT-PCR im Phloem. Die stärkste Expression findet man in starken "sinks", wie der Blüte, im Keimblatt, im Spross und jungen, noch nicht photosynthetisch aktiven Blättern. Verwandelt man ein source-Blatt durch Verdunkelung und Begasung mit CO₂-freier Luft in ein sink, steigt die VFK1-mRNA auf das 2-3 fache (Abb. 10). In dieser Weise behandelte Blätter häufen in Folge von Saccharose-Import und Aktivität der apoplastischen Invertase Glucose und Fructose in diesen "künstlichen" sinks an. "Füttert" man ein source-Blatt mit Saccharose, Glucose oder Fructose und vergleicht die VFK1 Transkriptmengen, findet man bei Behandlung mit Fructose 2-3fach erhöhte Werte (Abb. 11). Im Einklang mit einer höheren Kanaldichte wird nach Fructose-Behandlung das Membranpotential der Siebröhre von der Kaliumleitfähigkeit dominiert. Die höchsten VFK1-Mengen findet man während der Beladung des Keimblattes mit Speicherstoffen (Abb. 12). Hierbei wird auch Saccharose aus dem Phloem entladen und die Spaltprodukte der Invertasereaktion durch Hexosetransporter in das sink geladen. Der Befund, dass sowohl der Hexose/H⁺-Symporter VfSTP1 als auch VFK1 die gleichen Expressionskinetiken bei der Keimblattentwicklung zeigen, weist auf eine Beteiligung von VFK1 an der Steuerung der Phloementladung hin. Der VFK1-Gradient im Stängel, d.h. die Zunahme der Transkriptmenge im Transportphloem in basipetaler Richtung (Abb. 13), lässt außerdem auf eine Beteiligung von VFK1 an der K⁺-Rezirkulation vom source zum sink schließen. Einen Hinweis hierfür liefert die im Licht etwa 30 % höheren Saccharosekonzentration im Vergleich mit dem VFK1-Expressionslevel (Abb. 13). Am Tage herrschen demnach Bedingungen, bei denen die Transportrate von Zucker im Phloem um den gleichen Betrag zunimmt wie die Kanalexpression. VFK1 ist demnach ein Kaliumkanal, der sowohl bei der Regulation des Zucker-Langstreckentransportes, als auch bei der Kontrolle des Membranpotentials im Zusammenhang mit der Zuckerentladung beteiligt ist.

Unsere Untersuchungen der Maiskoleoptile zeigten neben dem durch Auxin induzierbaren ZMK1 (siehe 3.2 Wachstum) mit ZMK2 einen weiteren im Leitgewebe lokalisierten Kaliumkanal [17]. Im Gegensatz zu ZMK1 verhält sich ZMK2 in Oocyten nahezu spannungsunabhängig und wird durch externe Protonen inhibiert (siehe 3.2 Wachstum und Philippar et al., 1999). Diese funktionellen Eigenschaften von ZMK2, einem Mitglied der AKT3-Unterfamilie der pflanzlichen Shaker-Typ K⁺-Kanäle, entsprechen dem Verhalten der in Phloemzellen lokalisierten Kanäle AKT3 und VFK1 [16].

Die RNA von ZMK2 konnte auch im Mesokotyl nachgewiesen werden. Dieser Befund wurde durch Patch-Clamp-Messungen an Protoplasten unterstrichen. In Zellen aus der Stele vom Maismesokotyl dominierte, im Gegensatz zu Kortexzellen, ein spannungsunabhängiger Kaliumkanal, der einen Einzelkanalleitwert von 22pS hatte. Dieser Kaliumstrom nahm, ebenso wie die ZMK2-induzierten Kaliumströme in Oocyten, durch extrazelluläre Ansäuerung ab. ZMK2 ist wahrscheinlich, ebenso wie die übrigen Mitglieder der AKT3-Unterfamilie, im Phloem lokalisiert und könnte dort, in Abhängigkeit des Membranpotentials, Kalium aus dem Phloem in das umliegende Gewebe entlassen. Dieses Kalium wiederum ist notwendig für die Auxin-induzierte, Turgor-getriebene Zellstreckung der Kortex- und Epidermiszellen. Darüber hinaus könnte ZMK2 eine wichtige Rolle im Ladungsausgleich und in der osmotischen Anpassung während der Phloementladung spielen.

Das Phytohormon Auxin induziert das Streckungswachstum pflanzlicher Zellen ebenso wie das differentielle Wachstum, das bei der phototropen und gravitropen Krümmung von Koleoptilen und Hypokotylen beobachtet werden kann. Schon seit den Arbeiten von Charles Darwin im vorletzten Jahrhundert dient die Maiskoleoptile als ein klassisches Modellsystem zur Studie der hormonellen Regulation des Pflanzenwachstums, da das Längenwachstum der Koleoptile ausschließlich durch die Streckung der vorhandenen Zellen hervorgerufen und nicht von Zellteilungen begleitet wird. In der Gegenwart von externem K⁺ zeigen Koleoptilen 20 Minuten nach der Stimulation durch Auxine ein ausgeprägtes Streckungswachstum. Dieses Wachstum ist streng K⁺-abhängig und kann durch die Zugabe von K⁺-Kanal Blockern inhibiert werden, was darauf hindeutet, dass K⁺-Kanäle eine essentielle Rolle bei dem auxininduzierten Wachstum spielen.

Methoden: Klonierungstechniken, PCR, Sequenzierung, Northern Blot Analyse, in situ Hybridisierung, heterologe Expressionssysteme (Xenopus Oocyten, Hefe), Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen-Technik, Isolierung pflanzl. Protoplasten, Patch-Clamp-Technik

Um die Rolle von K⁺-Kanälen bei der Auxin-Wirkung untersuchen zu können, wurden K⁺-Kanalgene aus Zea mays Keimlingen isoliert. Mit der Hilfe degenerierter Oligonukleotid-Primer und RACE-PCR Techniken konnten wir die cDNA Moleküle ZMK1 und ZMK2 (Zea mays K⁺ channels 1 und 2) aus schnell wachsendem Koleoptilengewebe isolieren [17]. ZMK1 (GenBank Zugang Y07632) und ZMK2 (GenBank Zugang AJ132686) gehören zu der Shaker-Typ Familie pflanzlicher K⁺-Kanäle (Abb. 14A). Nach Northern Blot Analysen und in situ Hybridisierungsexperimenten werden ZMK1 in Kortex bzw. Epidermis und ZMK2 im Leitgewebe von Koleoptile und Mesokotyl exprimiert (Abb. 14B).

Nach heterologer Expression in Oocyten des Krallenfroschs Xenopus laevis konnte das Genprodukt von ZMK1 durch Messungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen-Technik als einwärtsgleichrichtender K⁺-Kanal charakterisiert werden (Abb. 15A und [17]). ZMK1 wird durch eine extrazelluläre Ansäuerung aktiviert und weiterhin durch die K⁺-Kanalblocker Cs⁺ und TEA⁺, die auch das Auxin-induzierte Wachstum der Koleoptilen inhibieren [17]; [18], geblockt. Zusammen mit seiner Lokalisation in Kortex/Epidermis der Koleoptile, weisen diese Ergebnisse auf eine mögliche Rolle von ZMK1 bei dem auxin- und säureinduzierten Wachstum der Maiskoleoptile hin. Im Gegensatz zu ZMK1 verhält sich ZMK2 in Oocyten nahezu spannungsunabhängig und wird durch externe Protonen inhibiert (Abb. 15B und [17]). Diese funktionellen Eigenschaften konnten durch weitere Experimente unserer Arbeitsgruppe den Phloem-lokalisierten K⁺-Kanälen zugeordnet werden (siehe 2.).
Mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik wurden die Genprodukte von ZMK1 und ZMK2 in einzelnen Pflanzenzellen in vivo untersucht. Hierzu wurden aus dem Kortex von Maiskoleoptilen bzw. aus den Leitbündeln des Maismesokotyls Protoplasten isoliert. In Kortexzellen dominierte ein einwärtsgleichrichtender, ZMK1-ähnlicher Kaliumkanal mit einem Einzelkanalleitwert von 6 - 8 pS die Ionenleitfähigkeit der Plasmamembran. Sowohl in Kortexzellen, als auch in Oocyten, die ZMK1 exprimierten, nahm der Kaliumeinstrom durch extrazelluläre Ansäuerung zu (Abb. 15C). In Zellen aus dem Leitgewebe des Maismesokotyls dominierte, im Gegensatz zu Kortexzellen, ein spannungsunabhängiger, Protonen-geblockter ZMK2-ähnlicher Kaliumkanal, der einen Einzelkanalleitwert von 22pS hatte (Abb. 15D und siehe 2.).

Methoden: Aufzeichnung pflanzl. Streckungswachstum, Northern Blot Analyse (Quantifizierung), semi-quantitative PCR und RT-PCR, GC-MS Analytik (Konzentrationsbestimmung Phytohormone), Auxin-Physiologie, Patch-Clamp-Technik

Um die molekularen Mechanismen, die dem Koleoptilenwachstum und Gravitropismus zugrunde liegen, aufzuklären und die Rolle des einwärtsgleichrichtenden K⁺-Kanals ZMK1 in der Zellelongation zu untersuchen, wurden Wachstumsraten von auxinstimulierten Maiskoleoptilen aufgezeichnet (Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Böttger, Institut für Allgemeine Botanik, Universität Hamburg). Parallel zur Aufzeichnung der Elongation der Koleoptilensegmente mit Hilfe von "Auxanometern" konnten wir zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Auxin-Stimulation Gewebeprobe entnehmen und einer Northern Blot Analyse zuführen. Hier zeigte sich, dass die Expression des K⁺-Kanalgens ZMK1 durch Auxin induziert wird und die vermehrte Produktion von ZMK1-mRNA zeitlich mit der Kinetik des Koleoptilenwachstums korreliert [17]. Weiterhin ist die transkriptionelle Induktion von ZMK1, einem früh in der Auxin-Signalkette induziertem Gen ("early-auxin-response gene"), auf aktive, wachstumsfördernde Auxine beschränkt. Mit ZMK1 konnte damit neben der Protonen-ATPase das erste auxininduzierte Gen bekannter Funktion auf der Ebene der Plasmamembran identifiziert werden.

Nach der Gravistimulation von Maiskeimlingen konnten wir über eine GC-MS Analytik in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Sandberg (Institut für Forstgenetik und Pflanzenphysiologie, Schwedische Universität für Agrarwissenschaften, Umeå, Schweden) die Umverteilung des endogenen Auxins (beta-Indolessigsäure, IAA) in der Koleoptile verfolgen. Dieser Auxinumverteilung auf die untere Koleoptilenhälfte folgte die asymmetrische Expression von ZMK1, die wiederum der negativ-gravitropen Wachstumsantwort der Koleoptile (erhöhtes Wachstum auf der Unterseite) vorausging (Abb. 16 und [17]). In Bezug auf die Auxininduktion diente der Transkriptgehalt von ZMK2 als Negativ-Kontrolle, da dieser weder durch exogenes Auxin noch durch Gravistimulation beeinflusst wurde.

In Übereinstimmung mit der Tatsache, dass ZMK1 zu den frühen auxininduzierten Genen gehört (Expression unabhängig von der Proteinneusynthese), zeigten Kortexzellen nach Auxinvorbehandlung, eine Zunahme in der Dichte des Kaliumeinstroms [17]. Durch Messungen mit Hilfe der Patch-Clamp Technik an auxinbehandelten Maisprotoplasten konnte damit bestätigt werden, dass in Antwort auf das Auxinsignal neue K⁺-Kanalproteine in die Plasmamembran der Zellen integriert werden. Sowohl aufgrund seiner Lokalisation, als auch aufgrund seiner transkriptionellen und post-translationalen Aktivierung, könnte ZMK1 daher eine Grundvoraussetzung für auxin- und kaliumabhängiges Koleoptilenwachstum und die gravitrope Krümmung sein [19].

Methoden: Screening von Phagen-Banken, Genanalyse, "Particle Bombardement" Technik, Transformation von Maisprotoplasten, Reverse Genetik an Mais, Robertsons Mutator Transposable Element System

Um die Signaltransduktion von Auxin zu dem "early-auxin-response" Gen ZMK1 im Detail zu untersuchen, wurde die komplette Gensequenz von ZMK1 aus genomischer DNA aus Mais (Phagen-Bank) isoliert. Das Gen ZMK1 setzt sich aus 11 Exon- und 10 Intronbereichen zusammen (Abb. 17). Durch Sequenzanalyse der potentiellen Promoterregion konnte vor den möglichen TATA- und CAAT-Boxen ein cis-Element ("auxin-response element", AuxRE) identifiziert werden, das eine entscheidende Rolle bei der Auxin-Signaltransduktion spielt [19]. Dieses AuxRE mit der Consensus-Sequenz "TGTCNC" ist spezifisch für "early-auxin response" Gene und wird von dem ARF-Transkriptionsfaktor der Auxin-Signalkette erkannt. Zur Zeit untersuchen wir die Auxin-Sensitivität von ZMK1-Promoter-Reportergen Konstrukten mit Hilfe der "Particle Bombardement" Technik und der transienten Transformation von Maisprotoplasten. Noch folgende Screening Verfahren (Hefe Two/One Hybrid Systeme) sollen zur Identifikation von Transkriptionsfaktoren von ZMK1 führen.

Um die postulierte Rolle von ZMK1 bei dem pflanzlichen Streckungswachstum beweisen zu können, wurden ZMK1 Knock-out Pflanzen mit Hilfe des "Robertsons Mutator Transposable Element Systems" aus Mais isoliert (Zusammenarbeit mit Dr. K. Edwards, IACR, Universität Bristol, Long Ashton, England). Basierend auf der Technik der reversen Genetik konnten über PCR-Experimente auf 25000 Mutator-Pflanzen 3 unabhängig, mutierte Allele mit Transposoninsertionen innerhalb des ZMK1-Gens identifiziert werden. Nach der Rückkreuzung und der Erzeugung homozygoter Mutanten werden wir in Kürze zeigen können, ob und inwieweit die Expression von ZMK1 eine Grundvoraussetzung für Koleoptilenwachstum und Gravitropismus darstellt.

Die Holzbildung ist das Ergebnis von cambialen Zellteilungen, Zellstreckung und Zelldifferenzierung. Das schnelle Wachstum im Frühjahr, eine Periode des langsameren Wachstums im Sommer und die Ruheperiode im Herbst/ Winter setzen eine strenge Koordination und Regulation zellulärer Prozesse voraus. Das Holz bezieht als Speicherorgan zum Ende der Wachstumsperiode Zucker, Aminosäuren, Hormone und anorganische Ionen aus den source-Blättern und wird zu Beginn der nächsten Wachstumsphase selber zu einer Art source-Gewebe. Photoassimilate, Hormone und Ionen werden dann aus dem Holz, speziell aus dem Parenchym und den Markstrahlen, zu den verbrauchenden cambialen Regionen in Stamm und jungen Blättern transportiert. Sowohl die Auxin-Konzentration als auch der Kalium-Gehalt des Kambiums (Abb. 18) nehmen während seiner Aktivierung stark zu. Cambiale Aktivierung und Deaktivierung stellen demnach die Schlüsselereignisse bei den Übergängen zwischen Ruhe- und Wachstumsperioden des Holzes dar. Im Mittelpunkt unserer Forschung im DFG Schwerpunktprogramm 322 717 "Der Apoplast der höheren Pflanze: Speicher-, Transport- und Reaktionsraum" stehen

• kaliumabhängige Cambiumaktivität
• Identifizierung der Kaliumtransporter und
• Ihre Regulation durch den Ernährungsstatus und Phytohormone

Das zum Wachstum benötigte Kalium wird entweder über das Xylem, das wahrscheinlich durch einen Kaliumabgabekanal im Xylemparenchym gespeist wird, oder über das Phloem bezogen. Weiterhin können die Kaliumspeicher in den Markstrahlen mobilisiert werden. Hierbei sind vermutlich hoch-affine Kaliumtransporter beteiligt. Ein Forschungsziel unserer Arbeiten zur Holzphysiologie ist diese Kaliumtransporter zu klonieren, zu lokalisieren und elektrophysiologisch zu charakterisierten um anschließend die Regulation und Physiologie der Transporter, sowie deren Rolle beim Holzwachstum zu klären.

Vor diesem Hintergrund haben wir eine EST-Datenbank aus dem Xylem-/Cambium- und Phloembereich des Holzes von Populus tremula mit den derzeit bekannten pflanzlichen Kaliumtransportern auf Sequenzähnlichkeiten überprüft. Dabei wurden Klone mit relevanten Homologien zu Kaliumkanälen und -Carriern identifiziert. Nach vollständiger Sequenzierung der ersten ESTs wurden eindeutige Homologe zu SKOR (stelar K⁺ outward rectifying channel), dem ersten pflanzlichen auswärtsgleichrichtenden Shaker-Typ-Kaliumkanal, dem Phloemkanal AKT3 (Arabidopsis K⁺ transporter), dem auxininduzierten Kanal ZMK1 (Zea Mays K⁺ channel), sowie zwei hoch affinen Kaliumtransportern nachgewiesen.

Mittels RACE-Techniken gelang es uns den SKOR1-homologen Kaliumkanal PTORK (Populus tremula outward rectifying K⁺ channel), den putativen Phloemkanal PTK1 (Populus tremula K⁺ channel) und einen der hoch-affinen Transporter zu klonieren. Durch heterologe Expression in Xenopus Oocyten konnten PTORK und PTK1 elektrophysiologisch charakterisiert werden. Wie schon SKOR erwies sich PTORK als spannungsabhängiger Kalium- Effluxkanal (Abb. 19). PTK1 zeigte dagegen das typische Verhalten der Kanäle der AKT3-Familie (Abb. 20), die sich durch schwache Spannungsabhängigkeit und einen Protonenblock auszeichnen [16].

Diese Kanäle und Transporter werden derzeit lokalisiert und funktional charakterisiert. Zur Analyse der Transporteigenschaften werden die Kanäle und Carrier in Hefezellen exprimiert und mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Die "in vitro" Eigenschaften werden mit denen, die mittels 2-Elektroden-Voltage-Clamp an Lebendschnitten (Abb. 21) "in vivo" gewonnen wurden, verglichen. Mit Hilfe der Lebendschnitte sollen Kaliumströme und -verteilungen aufgelöst werden. Um die signifikante Rolle des Kaliums für das Holzwachstum zu veranschaulichen, werden sense- und antisense-Pappeln erzeugt und Phänotypen verglichen. Hierfür werden Kaliumverschiebungen im Wildtyp und in transgenen Pflanzen im Jahresverlauf mittels Röntgenmikrosonden (EDXA SIMS) und Perfusionstechniken gemessen. Die Bestimmung der Kaliumflüsse im Vergleich von transgenen und Wildtyppflanzen werden ebenso wie die elektrophysiologischen Messungen zur Klärung der Rolle von Kaliumtransportern bei der Holzbildung beitragen.

Die Vakuole einer ausgewachsenen Pflanzenzellen nimmt 90% - und mehr - des Zellvolumens ein. Dies bedeutet, dass fast alle Ionen, die in eine Zelle aufgenommen werden, in die Vakuole transportiert werden, und Ionen, die aus der Zelle entlassen werden, stammen fast ausschließlich aus der Vakuole. Um die Ionenhomöostase des Cytosols zu gewährleisten, müssen daher die Transportprozesse über die Plasmamembran und über die Vakuolenmembran exakt koordiniert sein,. Als Grundlage für unsere Untersuchungen wurden zunächst die Konzentrationen der verschiedenen physiologisch bedeutsamen Ionen auf beiden Seiten der Vakuolenmembran - also im Cytoplasma und im Vakuoleninneren - bestimmt. Neben der bereits bekannten deutlich höheren Konzentration von Ca²⁺ und Protonen im Inneren der Vakuole, zeigen unsere Messungen etwa gleiche Konzentrationen von K⁺ auf beiden Seiten der Vakuolenmembran, während die Cl^--Konzentration im Inneren der Vakuole deutlich höher ist als im Cytoplasma [20]. Cl^- wird folglich unter Energieverbrauch in der Vakuole akkumuliert, im Gegensatz zu der bisherigen Annahme einer Gleichverteilung zwischen Cytoplasma und Vakuoleninnerem. Auf der Basis dieser Befunde haben wir zwei verschiedene Kaliumkanäle charakterisiert: Zum einen ein Kanal, der neben K⁺ auch Ca²⁺ und andere Kationen leitet [21] und der in hoher Dichte in allen Zellen verschiedenster Landpflanzen nachzuweisen ist. Zum anderen ein Ca²⁺-regulierter Kaliumkanal [22], der vorwiegend in wachsenden - und Speichergeweben zu finden ist und der eine zentrale Rolle bei der Ionenaufnahme während des Wachstums und der Entwicklung von Pflanzenzellen spielt. Dieser Ionenkanal erlaubt vornehmlich die Aufnahme monovalenter Kationen in die Vakuole (Brüggemann et al., 1999a). Auch die beobachtete Gleichverteilung von K⁺ zwischen Cytoplasma und Vakuoleninnerem, geht höchstwahrscheinlich auf die Aktivität dieses Ionenkanals zurück. Neben Ca²⁺ [22] und Mg²⁺ [23] werden beide vakuoläre Kationenkanäle effektiv durch Polyamine reguliert [24], die bei der Entwicklung und Differenzierung sowie bei der Bewältigung verschiedenster Stresssituationen in Pflanzenzellen eine Schlüsselfunktion haben. Speziell unter ungünstigen Wachstumsbedingungen wie Salzstress oder Kalium-Mangel ist die Regulation der Kationenkanäle der Vakuolenmembran durch Polyamine von zentraler Bedeutung für eine effektive Anpassung des pflanzlichen Mineralstofftransports an die sich rasch ändernden Umweltbedingungen. Aufbauend auf einem Verständnis der physiologischen Funktion der Ionenkanäle der Vakuole haben wir so in der letzten Zeit die molekularen Mechanismen aufgeklärt, die es der Zelle erlauben, die Ionenkanäle der Vakuolenmembran in ihrer Aktivität effektiv zu regulieren. Diese Regulation der Ionenkanäle ist lebensnotwendig für Pflanzenzellen, um die Ionenaufnahme und -abgabe an die herrschenden Umweltbedingungen anzupassen.

Bei mykorrhizierten Pflanzen werden Makro- und Mikronährstoffe wie K⁺, NO₃^-, PO₄^3-, SO₃^2-, sowie Cu⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺ und Ni²⁺ verstärkt über die Wurzel aufgenommen und ins Xylem geladen. Damit verbessert der Pilz die Nährstoffversorgung der Pflanze und erzeugt eine häufig beobachtete, bedingte Schwermetall-Toleranz.

Im Xylem der Wurzeln von mykorrhizierten Pflanzen werden außerdem erhöhte Kaliumkonzentrationen gefunden. Diese lassen sich auf eine gesteigerte Kaliumaufnahme aus dem Boden zurückführen. Hierfür gibt es zwei Möglichkeiten. Entweder wird Kalium über pilzspezifische Transporter aufgenommen und der Pflanze zur Verfügung gestellt, oder der Pilz induziert oder aktiviert die Kaliumaufnahmesysteme der Pflanze.

Pilze nehmen Kalium über das niederaffine TRK1/TRK2-System und hochaffine KUP-Transporter (K⁺ uptake) auf. In Pflanzen wird diese Aufgabe von Kaliumkanälen und Vertretern der HKT1- (für high-affinity-K⁺-transporter) und KUP-Familien übernommen (Brüggemann et al., 1999). Da Pilze in der Lage sind, je nach Kaliumangebot, zwischen niederaffinen und hochaffinen Kaliumtransportern umzuschalten untersuchen wir derzeit folgende Fragen:

Induziert die Symbiose durch verstärktes Kaliumangebot an die Pflanze ein Umschalten von Kaliumaufnahme über KUPs (hochaffin) zu Kaliumkanälen (niedrigaffin) ? oder

versetzt sie die Pflanze durch Induktion der hochaffinen Transporter in die Lage das Bodenkalium effektiver aufzunehmen ?

Aufbauend auf unseren Untersuchungen zum kaliumabhängigen Holzwachstum (siehe 3.4. Wachstum) sollen in diesem Projekt (DFG-Antrag eingereicht) die molekularen Mechanismen Kalium- und Ammoniumabhängiger Prozesse bei der Mykorrhiza-Infektion der Pappelwurzel, sowie wirtsspezifische Veränderungen der Flüsse dieser Ionen aufgeklärt werden. Hierzu werden ausgehend von Pappel ESTs Auxin-, ABA- und zuckerregulierte Kalium- und Ammoniumtransporter kloniert, lokalisiert und charakterisiert. Hierbei interessiert uns insbesondere der Zusammenhang zwischen den durch die verschiedenen Transporter gesteuerten Flüssen und der Ausbildung der Pflanze-Pilz-Symbiose. Beim Übergang in den symbiotischen Zustand sollen deshalb die Pilz-induzierten Änderungen der Kalium- und Ammoniumkonzentrationen und -flüsse in der Wurzel und die Expressions- und Aktivitätsmuster der hierfür verantwortlichen Kanäle und Carrier gezielt untersucht werden.

Stickstoff ist eines der wichtigsten Makroelemente für die Ernährung höherer Pflanzen und nimmt eine zentrale Stellung in vielen physiologischen Prozessen der Pflanze ein. Pflanzen benötigen für optimale Entwicklung und maximales Wachstum große Mengen an Stickstoff, den sie in Form von Nitrat oder Ammonium aus dem Boden aufnehmen. N-limitierende Bedingungen im Boden führen zu typischen Krankheitsbildern wie z. Bsp. Zwergenwuchs oder Chlorosen. Da die Nutzung des atmosphärischen Stickstoffs ausschließlich Porkaryonten vorbehalten ist, können Pflanzen, die auf stickstoffarmen Böden wachsen können ihren Stickstoffbedarf durch eine symbiontische Interaktion mit diesen Stickstoff-fixierenden Bodenbakterien decken. Einige dieser Bodenbakterien, wie z. Bsp. Azospirillum sp. Leben in enger Assoziation auf der Wurzeloberfläche ihrer Wirtspflanzen und fördern Wachstum und Entwicklung ihrer Wirte (Abb. 22). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Fendrik (Institut für Biophysik der Universität Hannover) untersuchen wir die molekularen Mechanismen dieser Pflanze-Bakterium Interaktion. In ersten Untersuchungen zur Rolle des primären Fixierungsproduktes, NH₄⁺, konnte wir zeigen, dass nach Inokulation von Tomatenpflanzen mit Azospirillum brasilense die Transkription des wurzelspezifischen Ammoniumtransporters LEAMT1;2 induziert wird. Da bakterielle Mutanten mit einem Defekt im Nitrogenase-Gen, die Induktion des LEAMT1;2 nicht bewirken können, vermuten wir neben einer Substrat- auch eine Signalfunktion für das Ammonium (Abb. 23). Weiterführende Untersuchungen konnten zeigen, dass das Ammoniumion selbst einer der wichtigsten Induktoren des LEAMT1;´2 Gens ist. Die Genaktivität wird dabei konzentrationsabhängig durch NH₄⁺ reguliert (Abb. 24). Die Inhibition des LEAMT1;2 Gens durch die Aminosäure Glutamin sowie durch den Glutaminsynthase Blocker MSX deutet darauf hin, dass die interne, cytoplasmatische Ammoniumkonzentration sowie der N-Status der Pflanze regulierend auf den Ammoniumtransport wirken (Abb. 25). Da bereits mikromolare Konzentrationen an extern appliziertem NH₄⁺ Ammonium ausreicht, um die Transkription des LEAMT1;2 Gens zu induzieren, vermuten wir dass dem transportierten NH₄⁺ ein Schlüsselsignal in der Interaktion zwischen Azospirillum und höheren Pflanzen zukommt.

Agrobacterium tumefaciens ist der Auslöser von Wurzelhalsgallen, einer Erkrankung die in erster Line bei Dikotyledonen auftritt und durch tumorartiges Wachstum charakterisiert ist (siehe Abb. 26A, B). Bei Winzern ist diese Krankheit als "Mauke" bekannt, die bei Befall ganzer Bestände zu erheblichen Ertragseinbußen führt. Die unkontrollierte Proliferation der pflanzlichen Zellen ist das Ergebnis der Expression von Genen, die bakteriellen Ursprungs sind und stabil ins pflanzliche Genom integriert werden. Sie veranlassen die Pflanzenzelle zur Produktion der Phytohormone Auxin und Cytokinin sowie der Aminosäuren der Octopinklasse. Der Tumor stellt ein starkes Sink für die Pflanze da. Er reichert in großen Mengen Kaliumionen und Zucker an. Außerdem zeichnet ihn eine stark erhöhte Transpirationsrate aus. Im Gegensatz zu den guten Kenntnissen über den strukturellen Aufbau der Tumore (siehe Abb. 26C, D) sowie verschiedener physiologischer und biochemischer Parameter ist die Rolle der Stofftransporter, welche die optimale Versorgung des Tumors gewährleisten, gänzlich unbekannt. Diese in der Membran lokalisierten Saccharose-, Hexose- bzw. Ionentransporter dienen als Eintrittsstelle für Nährstoffe in die Tumorzelle und ermöglichen ihm optimales und schnelles Wachstum. Damit liegt der Verdacht nahe, dass diese Ionentransporter an der Proliferation der Tumorzellen beteiligt sind. Am Prozess der Tumorentstehung durch Agrobakterien sind zweifellos die in hoher Konzentration vorliegenden Phytohormone maßgeblich beteiligt. Welchen Einfluss diese Wachstumsregulatoren auf die transkriptionelle bzw. posttranslationale Regulation der Stofftransporter und damit auf die Nährstoffversorgung der Tumorzelle auf der einen Seite und der Bakterien auf der anderen haben, ist jedoch gänzlich unbekannt. Für die Aufklärung der Ursache des schnellen tumorösen Gewebewachstums ist deshalb ein detailliertes Wissen über die Regulation der Nährstofftransporter während der Tumorgenese von grundlegender Bedeutung. Im Rahmen eines SFB-Projektes wollen wir an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana prüfen, welche Rolle Stofftransportproteine in den verschiedenen Stadien der Tumorgenese und Ernährung der Agrobakterien spielen. Anhand der Untersuchungen zur Expression und Regulation von Stofftransportern wie K⁺-Kanälen, H⁺-ATPasen, Zucker- und Aminosäuretransporter sollen Vertreter identifiziert werden, die als Marker definierte Stadien der Tumorgenese charakterisieren.

Bei Untersuchungen zur differentiellen Expression unterschiedlicher Kaliumkanalsubtypen in den verschiedenen Geweben von A. thaliana zeigen die jeweiligen Subtypen charakteristische Expressionsmuster . Ein vergleichbares Bild ergab die Untersuchung von Tumorgewebe an der Blattrosette von A. thaliana. Mittels RT-PCR konnten wir zeigen, dass dort eine K⁺-Kanal mRNA exprimiert wird, die in der nicht-infizierten Rosette nicht zu finden ist. Dieser normalerweise in Wurzeln exprimierte K⁺ Kanal ist für die Aufnahme von Kalium aus dem Boden und damit für die Versorgung der Pflanze mit diesem Nährelement verantwortlich. Möglicherweise sorgt der K⁺ Aufnahmekanal auch im Tumorgewebe für die Kaliumaufnahme und Wachstum. Weiterhin konnten wir im Tumorgewebe einen neuen Liganden-aktivierten Ionenkanal nachweisen. Zwei sonst im Spross exprimierte K⁺-Kanäle waren im Tumor hingegen nicht zu finden. Der im Phloem und Xylem aller oberirdischen Organe von A. thaliana exprimierte Ionenkanal wird ausschließlich mit grünem, photosynthetisch aktivem Source Gewebe exprimiert [16], [15]. Da der Tumor aber ein starkes Sink darstellt, scheinen diese K⁺-Kanalgene des Sprosses während der Tumorgenese inaktiviert zu werden. Gleichzeitig wird das Kanalgen für Kaliumaufnahme aktiviert. Hierdurch wird der Abtransport von K⁺ sowie C- und N-reicher Verbindungen verhindert. Das bedeutet, dass der Tumor zur Einbahnstrasse für diese Nährstoffflüsse wird.

Pflanzen nehmen anorganischen Stickstoff überwiegend als Nitrat aus dem Boden auf. Nitrat und seine primären Reduktionsprodukte spielen in Pflanzen eine zentrale Rolle als Substrate, aber auch als Signale, die Wachstum, Entwicklung, Stresstoleranz und Pathogenabwehr kontrollieren (Abb.27).

Reduktion des Nitrats erfolgt sowohl in Wurzeln als auch in Blättern. Diese Reduktion ist eine mehrstufiger Prozess, dessen erste Stufe im Cytosol durch die assimilatorische Nitratreduktase (NR) katalysiert wird. Wir haben in den vergangenen Jahren in Kooperation mit SC Huber (Universität Raleigh, North Carolina, USA) die komplexe Regulation dieses Enzyms mit aufgeklärt. NR wird durch Proteinkinasen an einem bestimmten Serin-Rest zu P-NR phosphoryliert, der durch spezifische Proteinphosphatasen wieder entfernt werden kann. P-NR bindet in Gegenwart von divalenten Kationen ein 14-3-3-Protein. Der so entstandene Komplex ist katalytisch völlig inaktiv. Er wird immer dann gebildet, wenn keine oder wenig Photosynthese stattfindet (Dunkel, CO₂-Mangel) [25], [26],[27], [28], [29], [30]). Signale zur Steuerung der Protein-Kinasen sind wohl vor allem Zuckerphosphate, aber auch AMP scheint eine Rolle zu spielen [27], [31]. In einem EU-Projekt "Nitrate signalling"konnten wir darüber hinaus zeigen, dass durch den beschriebenen Mechanismus auch die Lebensdauer des NR-Proteins reguliert wird: der P-NR-14-3-3 -Komplex wird in vivo rasch proteolytisch abgebaut, während freie NR viel stabiler ist [32]. Zusammen mit einer Steuerung der NR-Expression wird so nicht nur die katalytische Aktivität, sondern auch die Gesamtmenge an NR-Protein im Gewebe geregelt und die Nitratreduktion mit der Photosynthese, aber auch mit der Nitratversorgung [33] koordiniert. Auch unter Salzstress wird NR in Blättern abgebaut, aber in Wurzeln hochgeregelt [34], wobei wohl vor allem die Chlorid-bedingte Umverteilung des Nitrats zwischen Blättern und Wurzeln als Signal wirkt.

Bisher wurde davon ausgegangen, das alle NR's in höheren Pflanzen ähnlich reguliert werden. Nach unseren neuesten Erkenntnissen gibt es aber Ausnahmen. In Ricinus communis (möglicherweise auch in anderen Euphorbiaceen) weicht die Regulation der NR stark von dem obigen Schema ab [30], [35]. Die molekulare Basis und die physiologische und ökophysiologische Rolle dieser abweichenden Eigenschaften sind noch unklar und werden von uns untersucht.

Neben dieser Grundreaktion erfüllt NR wahrscheinlich noch weitere wichtige Funktionen. So bildet das Enzym z.B. auch Stickstoffmonoxid (NO), und zwar immer dann, wenn die Nitratreduktion die Rate der Nitritreduktion überschreitet und Nitrit akkumuliert. Dieses NO ist wahrscheinlich ein hormonartiges Signal in Pflanzen. Es scheint vor allem bei der Pathogenabwehr eine Rolle zu spielen. Die NO-Bildung durch NR und die NO-Emission von Pflanzen ist Thema eines DFG-Projektes in dem wir mit dem FZ Jülich (J. Wildt) kooperieren.

In Wurzeln erfüllt NR eine weitere wichtige Aufgabe: In nassen Böden leiden Wurzeln unter Sauerstoffmangel. Es findet Lactat- und alkoholische Gärung statt und der pH -Wert in den Wurzelgeweben sinkt [36]. Diese Ansäuerung ist lebensgefährlich und die Wurzeln werden auch weniger resistent gegen Pathogenattacken. Erfahrungsgemäß wird die Überflutungstoleranz von Wurzeln durch gute Nitratversorgung verbessert. In transgenem Tabak, bei dem die NR nur in den Blättern, aber nicht in den Wurzeln exprimiert wird, wird unter Anaerobiose in den Wurzeln viel mehr Ethanol und Lactat gebildet als im Wildtyp (Lebedevsky und Kaiser, unveröffentlicht). Dies zeigt, dass Nitratreduktion offensichtlich in der Lage ist, NAD⁺ für die Glycolyse zu recyceln und damit die schädliche Lactat/Ethanol-Bildung zumindest teilweise zu ersetzen (s. auch [37], [38]). Ob damit auch die zelluläre Ansäuerung verhindert wird, soll demnächst mittels NMR-Messungen in Kooperation mit der Universität Oxford (G. Ratcliff) überprüft werden.

Partielle Hemmung der mitochondrialen Atmung findet nicht nur unter Sauerstoffmangel statt. In Zusammenarbeit mit der BASF konnten wir zeigen, dass auch bestimmte neuere Fungizide vom Strobilurintyp in die Pflanzenatmung eingreifen und damit die Nitratreduktion aktivieren- dies ist eine der Ursachen dafür, dass diese modernen, biologisch leicht abbaubaren Fungizide Pflanzenwachstum und Erträge steigern, selbst wenn Pflanzen nicht von Pilzen befallen sind [39].

Trotz aller weitreichenden neuen Einsichten in die Rolle und Regulation der Nitratreduktion in höheren Pflanzen sind einige wichtige Aspekte nach wie vor unklar: so wissen wir z.B. noch immer nicht, warum unter bestimmten Bedingungen in der intakten Pflanze nur sehr wenig Nitrat reduziert wird, obwohl die Nitratreduktase voll aktiviert ist und obwohl im Cytosol genügend Nitrat zur Verfügung steht [30] Auch die Rolle des Nitrat-bürtigen Stickstoffmonoxids für die Pathogenabwehr von Pflanzen ist bisher mit vielen Fragezeichen zu versehen. Wir planen, diese Probleme in einem neuen SFB zu untersuchen. NR war das erste pflanzliche Enzym, an dem konkret die Rolle von 14-3-3-Proteinen nachgewiesen wurde. Inzwischen sind schon viele weitere "Targets"für diese Bindeproteine bekannt. Um so wichtiger wird es in Zukunft sein, Einsichten in die Regulation der 14-3-3-Verteilung auf diese Targets und in die zelluläre Kontrolle der 14-3-3-Bindung und des 14-3-3-Turnovers zu gewinnen.

Membranproteine mit der Funktion die Durchlässigkeit einer Biomembran für Wasser zu erhöhen sind in Prokaryonten, bestimmten tierischen Zellen und Pflanzenzellen gefunden worden. Ziel der Untersuchungen über pflanzliche Aquaporine ist es deren Funktion und Bedeutung für die Pflanze zu beschreiben.

Eine gewebe- und entwicklungsspezifische Expression des in der Plasmamembran lokalisierten Aquaporins PIP1b [40] konnte durch Nachweis von Reportergenaktivität in transgenen Pflanzen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass dieses Aquaporingen vorwiegend bei Zellstreckungsvorgängen, aber auch in Bereichen der Wurzel und des Sprosses aktiviert wird, die nahe der Leitgefäße liegen (Abb. 28).

Nach Transformation von Arabidopsis mit einem Antisense-PIP1b-Konstrukt konnte eine drastische Verminderung der entsprechenden mRNA in den Transgenen nachgewiesen werden. Die Pflanzen zeigten ein verstärktes Wurzelwachstum [41], welches als Kompensationsreaktion einer verminderten zellulären Wasserpermeabilität von Wurzelzellen erklärt wird (Abb. 29).

Der Nachweis der reduzierten Wasserpermeabilität gelang mit mikroskopischen Methoden an Einzelzellen oder mit Hilfe eines Coulter Counter an Populationen von Protoplasten [42].

Weitergehende Untersuchungen des Wassertransports in den Arabidopsis-Antisense Pflanzen mit biophysikalischen Methoden wie bildgebende NMR (Prof. Haase) oder Druckmeßsonde (Prof. Zimmermann) sind an technischen Problemen gescheitert. Diese wurden vor allem durch die geringe Größe der Pflanzen, bzw. das begrenzte Auflösungsvermögen der Geräte verursacht. Aus diesem Grunde wurde ein homologes Aquaporin aus Tabak isoliert und charakterisiert. Es gelang mit diesen Untersuchungen zum ersten Mal ein pflanzliches Aquaporin zu beschreiben, dass nicht strikt selektiv für Wasser ist [43]. Die Untersuchung von entsprechenden Antisense-Linien ist Gegenstand der aktuellen Forschung und hat bisher neue und entscheidende Erkenntnisse für das Verstehen der Grundlagen des pflanzlichen Wassertransports geliefert [44] [45] [46].

Die Symbiose von Pflanzen mit Pilzen, die sogenannte Mycorrhiza, ist weit verbreitet und liefert beiden Partnern wichtige Nährstoffe. In Zusammenarbeit mit Dr. Franken (MPI für terrestrische Mikrobiologie) konnte ein für die Symbiose wichtiges Aquaporin isoliert und dessen Funktion bestimmt werden [47].

Eine Zusammenarbeit mit Prof. Hedrich (Botanik I, Würzburg), Dr. Becker und Prof. Moran (Jerusalem, Israel) ermöglichte den Zugang zu einer cDNA-Bibliothek, die aus mRNA der Mimose Samanea saman hergestellt wurde. Es konnten zwei Gene isoliert werden, deren Genprodukte Aquaporine mit außergewöhnlich hoher Wasserleitfähigkeit sind. Durch die weitere Charakterisierung dieser Proteine konnten Prinzipien des proteinvermittelten Membran-Wassertransportes erkannt werden.

Mehrere Gene für Aquaporine konnten aus der Küchenzwiebel isoliert werden. Die weiteren Untersuchungen an diesem Objekt erscheinen als sehr lohnend, da es sich bei der Pflanze um eine Einkeimblättrige handelt, die typischerweise mit einer endogenen wasserundurchlässigen Schicht um die Wurzelleitgefäße versehen sind .

Aus einer Zusammenarbeit mit Prof. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) entstand ein Projekt, welches die Identifizierung von Resistenzgenen der Tomate als Bestandteil der Abwehrreaktion gegenüber Cuscuta reflexa zum Ziel hat. Durch Anwenden eines Verfahrens, das auf Subtraktion von cDNA-Populationen und Inhibitions-PCR beruht konnten mehrere relevante Klone isoliert werden. Die zugehörigen Genprodukte weisen auf die Beteiligung von zellwandabbauenden Enzymen hin.

Die gemeinsame Bearbeitung dieses Themengebietes mit Dr. Schwab (Lebensmittelchemie, Würzburg) lieferte einen cDNA-Klon, dessen zugehöriges Protein auf die Funktion einer O-Methyltransferase hinweist. Durch Expression des Proteins in E. coli und Enzymtest konnte die Funktion bestätigt werden. Es konnte somit ein entscheidender Schritt der Aromastoffsynthese mit molekularbiologischen Mitteln bestimmt werden.

In Zusammenarbeit mit Prof. Kaiser (Botanik I, Würzburg) wurde die Reaktion der Expression von Nitratreduktasegenen des Mais unter Hochsalzbedingungen untersucht [34].

Für Arabidopsis stehen eine Reihe von Mutanten in definierten Genen zur Verfügung. Die Defekte betreffen unter anderem Lichtrezeptoren und Phytohormone. Durch die Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Abszisinsäure, Auxin und der Lichtrezeptor Phytochrom an der lichtinduzierten Öffnung von Stomata beteiligt sind [48].

Eine Mitarbeiterin der Landesanstalt für Wein und Gartenbau hat im Labor Untersuchungen zur Verbreitung von Genprodukten aus transformiertem Wein durchgeführt. Die Arbeitsgruppe ist an der Begleitforschung zu einem Freisetzungsversuch von transformiertem Wein beteiligt.

In weiteren Experimenten mit Weinreben konnte ein Verfahren entwickelt werden, dass es erlaubt diese Pflanzen ohne Verwendung von Resistenzmarkergenen zu transformieren. Weiterführende Forschung wird in Zusammenarbeit mit der Rebenzüchtung der Fa. Steinmann betrieben.

Aus einer nicht-sterilen Kultur der extrem säureresistenten einzelligen Grünalge Dunaliella acidophila wurde ein fädiger Pilz isoliert und dessen systematische Zugehörigkeit sowie seine Säure- und Schwermetallresistenz analysiert. Ferner wurde geprüft, inwieweit kommensalistische Beziehungen zwischen Alge und Pilz bestehen.

Der Pilz konnte aufgrund zytologischer und ernährungsphysiologischer Merkmale der Familie der Desmetiaceae (Ordnung Moniliales, Ascomycetes, Fungus imperfectus) zu geordnet werden und stellt vermutlich eine neue Spezies der Gattung Bispora dar.

Im Gegensatz zum pH-Profil des Wachstums von Dunaliella acidophila (Optimum bei pH 1.0) ist das pH-Profil des Wachstums von Bispora sp. bimodial (ein Optimum bei pH 1, ein zweites Optimum bei pH 7.0). Dieses komplexe pH-Profil gestattet es, die differentielle Genexpression des gleichen Organismus bei pH 1 und pH 7 zu untersuchen. Bei pH 1.0 wird z.B. die Plasmalemma H⁺ - ATPase deutlich stärker exprimiert als bei pH 7.0. NMR-Untersuchungen zeigen, dass der Pilz in der Lage ist, bei einem Außen-pH von 1.0 einen cytosolischen pH um 7.3 aufrecht zu erhalten.

Bispora sp. kann Glyzerin als C-Quelle verwerten. Diese Substanz ist das Hauptosmotikum von D. acidophila und wird in geringem Umfang von der Alge ins Medium abgegeben, wo es als Substrat für das Wachstum des Pilzes dient. Bispora sp. ist autonom in Bezug auf die wasserlöslichen Vitamine B1, B2, B6, B12 und Folsäure und gibt einen Teil dieser Vitamine ins Kulturmedium ab. Diese Vitamine können wiederum von D. acidophila aufgenommen werden und das Wachstum der Alge stimulieren. Die Befunde erklären, warum D. acidophila in nicht-steriler Kultur signifikant besser wächst als in axenischer Kultur.

Bispora sp. kann sowohl NH₃ als auch NO₃ als N-Quelle benutzen. Bemerkenswert ist die Fähigkeit dieses Pilzes auf Cyaniden zu wachsen. Im Zusammenhang damit wurde untersucht, welche Amide Bispora sp. verstoffwechseln kann. Harnstoff kann weder als C- noch als N-Quelle genutzt werden, der Pilz besitzt keine Urease. Formamid kann nur in geringen Ausmaß als C- und N-Quelle genutzt werden, wohl dagegen Acetamid. Überraschender Weise enthält der Pilz aber keine Acetamidase, sondern nur Formamidase. Es wird vermutet, dass bei der Assimilation von Acetamid erst ein C1-Transfer stattfindet, bevor entstehendes Formamid umgesetzt werden kann.

Bispora sp. zeigt bei pH 1.0, ebenso wie D. acidophila, eine extrem hohe Resistenz gegen kationische Schwermetalle, während die entsprechende Resistenz bei pH 7.0 deutlich geringer ist. Diese wird auf positive Oberflächen- und Membranpotentiale bei pH 1.0 zurückgeführt, die die Aufnahme von Kationen erschweren. Durch die negativen Potentiale bei pH 7.0 wird die Auf­nahme kationischer Schwermetalle dagegen erleichtert.

In alkalischen Medien hoher Salinität scheidet aus thermodynamischen Gründen im Zusam­menhang mit einer Na⁺-Homeostase ein Na⁺/H⁺-Antiporter im Plasmalemma als Transportvehi­kel für einen Na⁺-Export aus. Deshalb sollten marine Algen im Plasmalemma primären Na⁺-Pumpen enthalten. Bislang konnten aber weder bei halophytischen höheren Pflanzen noch bei Algen primäre Na⁺-Pumpen, z.B. nach Art der tierischen Na⁺,K⁺-ATPasen nachgewiesen werden. Es gelang uns nun erstmals aus dem Plasmalemma der marinen Algen Tetraselmis viridis eine primäre Na⁺-ATPase zu isolieren und ihre Eigenschaften zu beschreiben.

Der Natrium-Transport dieser ATPase (gemessen mit ²²Na⁺ als Tracer) zeigt ein pH Opti­mum zwischen 7 und 8, erfordert die Anwesenheit von permeablen Anionen, ist resistent gegen Entkoppler und Amilorid, einen Hemmstoff des Na⁺/H⁺-Antiporters,. Die Pumpe ist empfindlich gegenüber Vanadat und vermutlich elektrogen. Phosphorylierungs-Experimente mit g-³²P-ATP zeigen, daß im katalytischen Zyklus ein Phosphorylierungsschritt beteiligt ist. Die Phosphorylierung eines 100 kDa-Proteins ist durch Natrium stimulierbar und durch Vanadate, ADP und Hydroxylamin hemmbar. Quabain hat keinen Einfluss. Die Ergebnisse zeigen, dass die Plasmalemma-Na⁺-ATPase von Tetraselmis viridis dem E₁E₂-Typ entsprechend dem Albers-Post-Schema zugeordnet werden kann. Es gibt aber bislang keinerlei Hinweise darauf, dass wie bei der tierischen Na⁺,K⁺-ATPase, Kalium an der Reaktion beteiligt ist.

MHKW-Schlacke wird nach den Bestimmungen des deutschen Kreislauf und Abfallwirt­schaftsgesetzes als Wertstoff klassifiziert und darf deshalb nicht mehr auf Reststoffdeponien end­gelagert werden. Stattdessen soll es als Baumaterial im Tiefbau verwendet werden (Ersatz für Sand beim Bau von Straßen, Dämmen, Parkplätzen usw.). MHKW-Schlacke zeichnet sich durch einen hohen Schwermetallgehalt, einen transient hohen Salzgehalt, sowie eine extreme Alkalität aus. Für die Ausbringung der MHKW-Schlacke im Freiland müssen deshalb bestimmte ge­setzli­che Bestimmungen eingehalten werden, die verhindern sollen, daß Schwermetalle ins Grundwas­ser bzw. den Kreislauf der Natur gelangen.

Wir untersuchen im Auftrag des Bayerischen Staatsministeriums für Landesentwicklung und Umweltfragen in sogenannten "worst case"-Studien im Labor und im Freiland (Deponien) in Kurzzeit- und Langzeit-Experimenten die Um­weltverträglichkeit der MHKW-Schlacke. Es zeigt sich, dass als Folge der hohen Temperaturen während der Ontogenese der Schlacke im Feuerofen des MHKWs und wegen der Alkalität der Bodenlösung von Schlacke Schwermetalle der Schlacke sehr immobil sind und kaum für die Pflanzen verfügbar. Die Transferkoeffizienten (Blätter/Substrat) von auf Schlacke kultivierten Pflanzen sind entsprechend niedrig. Phytotoxizitätsgrenzen für Schwermetalle werden deshalb nicht überschritten. Die Schwermetall - Gehalte von Eluaten der Schlacke sind extrem niedrig. So ist auch im "worst case"für das Grundwasser keine Belastung zu erwarten. Weitere Untersuchun­gen beschäftigen sich mit der Pufferkapazität der MHKW-Schlacke und der Frage, inwieweit auf Schlacke kultivierte Pflanzen die Rhizosphäre ansäuern können (H⁺-ATPase, Exudation von orga­nischen Säuren, Wurzelatmung usw.) und dadurch eine Mobilisierung von Schwermetallen induzieren können. Ferner wird untersucht welche Sukzessionen bei natürlicher Besiedlung auf offenen, nicht verdichteten Schlackeflächen im Vergleich zu Kontrollflächen auftreten.

Die Untersuchungen werden durchgeführt in Kooperation mit der Abteilung Deponieverhalten der Forschungs- und Entwicklungsstelle Sondermüll (FES) in Schwabach.

Vom submersen Lebermoos Riccia fluitans existiert eine aquatische und eine terrestrische Form. Im Verlauf der Umwandlung der submers lebenden Thalli in die Landform spielt Abscisinsäure eine wichtige Rolle. Die Biosynthese und der oxidative Abbau wurde mit Hilfe spezifischer Biosynthese- und Metabolisierungsinhibitoren untersucht. In den terrestrischen Thalli sorgen starke ABA-Flüsse am Tonoplasten für eine erhöhte ABA-Akkumulation in der Vakuole.

Abscisinsäure konnte in über 25 europäischen Flechtenarten nachgewiesen werden. Der Pilzpartner ist der Hauptsyntheseort für ABA. Im Gegensatz zu den Geweben höherer Pflanzen wird die Biosynthese der ABA unter optimalen Feuchtigkeitsbedingungen erhöht. ABA verhindert Schäden, die an den Thalli durch Tropfwasser erzeugt werden. Diese stressphysiologische Funktion der ABA konnte ebenfalls an antarktischen Flechten am originalen Standort beobachtet werden.

Wurzelsysteme die in eintrocknenden Böden wachsen, senden Abscisinsäure als Stresssignal zu den Blättern, den Stomata und den Meristemen. Böden extremer Standorte weisen neben einem geringen Wassergehalt oft hohe Salzkonzentrationen, niedrigen Nährstoffgehalt, hohe pH Werte und eine ungünstige Bodenstruktur auf. Alle diese Faktoren erhöhen die ABA-Synthese in den Wurzeln von Ricinus-Pflanzen. ABA wird im Xylem zu den Blättern transportiert, wo es bei Salzbelastung zu einer ABA-Akkumulation kommt. Phosphatmangel zeigt ähnliche Effekte wie Salzstress. Allerdings wird hier eine zu starke ABA-Akkumulation in den Blättern durch einen erhöhten oxidativen ABA-Abbau verhindert. Ein signifikanter Anteil der ABA wird über das Phloem zu den Wurzeln retransloziert, wo sie die hydraulische Leitfähigkeit der Wurzeln reguliert. Stoff- und ABA-Flüsse wurden auch in Ricinus-Pflanzen untersucht, die ausschließlich über die Blätter mit Nitrat oder Ammonium versorgt wurden.

Zu den im Xylem transportierten hormonellen Stresssignalen gehören auch ABA-Konjugate, insbesondere der ABA-Glukoseeester (ABA-GE), vor allem bei salzbelasteten Pflanzen. ABA-GE befindet sich neben freier ABA auch in der Bodenlösung und kann von den Wurzeln aufgenommen werden. Da aufgrund der niedrigen Permeabilität von Cortexmembranen und der Endodermis ABA-GE weder symplastisch noch apoplastisch weitertransportiert werden kann, wird ABA durch apoplastische Gukosidasen der Wurzelrinde aus den Konjugaten freigesetzt. Aus den Xylemparenchymzellen des Zentralzylinders werden ABA-Konjugate unter Salzstress und unter Bedingungen eines gehemmten oxidativen ABA-Abbaus verstärkt in das Xylem entlassen.

Im Apoplasten von Gerstenbklättern wurde ebenfalls eine Glukosidase isoliert und gereinigt, welche ABA-GE spalten kann und deren Aktivität unter Salzbelastung ansteigt.

Hormonelle Stresssignale können im Xylem durch verstärkte Wasserflüsse verdünnt und somit abgeschwächt werden. Eine solche Abschwächung wird durch einen apoplastischen "Bypass-Flow" direkt durch die Endodermis des Maiswurzel kompensiert. Die Maisendodermis stellt also keine perfekte Barriere für ABA dar. Der Reflektionskoeffizient sigma_ABA ist kleiner als 1. Er ist abhängig von der ABA-Konzentration und dem pH-Wert der Bodenlösung. In Sonnenblumenwurzen ist sigma_ABA größer als bei Maiswurzeln.

Die Exodermis der Maiswurzel, wie sie sich bei aeroponischen Kulturen bildet, stellt eine gute Transportbarriere für ABA dar. Sowohl die Aufnahme aus der Bodenlösung als auch die Ausscheidung in die Rhizosphäre wird durch eine Exodermis stark reduziert. Für ABA-GE sind Exodermis und Endodermis perfekte Transportbarrieren.

Chamaegigas intrepidus ist eine poikilohydrische Vertreterin der Scrophulariaceen, welche in flachen Wannen auf Granitfelsen in Zentralnamibia endemisch wächst. Die Granitwannen sind während der Regenzeit wiederholt für wenige Tage mit Wasser gefüllt. Somit erleiden die Pflanzen mehrere Austrockungs-/Befeuchtungs-Zyklen um anschließend 7-8 Monate bei absoluter Trockenheit zu überstehen.

Nach dem Bewässern erreichen die Wurzeln und submers lebenden Rosetten innerhalb von 2 Stunden ihre volle Stoffwechselaktivität zurück. Nach 24 h bilden sich Schwimmblätter, nach weiteren 1-2 Tagen erblühen die Pflanzen und bilden schließlich Samen.

Neben extremer Trockenheit sind die Pflanzen starken pH-Schwankungen, von pH 6 bei Sonnenaufgang bis pH 11 bei Sonnenuntergang ausgesetzt. Diese entstehen durch die photosynthetische CO2-Aufnahme der Chamaegigas-Blätter im schwach gepufferten Wasser. Der Nährstoffgehalt der Wassers ist extrem niedrig. Stickstoffhaltige Verbindungen liegen vor als Ammonium (40-50 mM), Harnstoff (40 mM) und Glycin (15 mM). Nitrat ist nicht nachweisbar. Harnstoff wird von Pavianen und Antilopen eingebracht.

Im Verlauf des Eintrocknens schrumpfen die Unterwasserblätter um bis zu 90% und ziehen sich somit in das Sediment der Wannen zurück. Somit sind sie vor dem hohen UV-Anteil des Sonnenlichtes geschützt. Das starke Schrumpfen wird durch kontraktive Tracheiden ermöglicht, welche einmalig im Pflanzenreich sind. Während des Eintrocknens werden große Mengen von Abscisinsäure, besonderer Schutzproteine (Dehydrine) und des Zuckers Stachyose gebildet. Die Biomembranen zeigen eine ungewöhnliche Stabilität bei Wassermangel, eine besonders effektive pH-Regulation ermöglicht das Leben unter den extremen pH-Schwankungen. Die wichtigste Stickstoffquelle ist das Ammoniumion, welches aus dem Harnstoff mittels des im Sediment befindlichen Enzyms Urease entsteht. Die Urease verliert auch nach monatelanger Hitze, Trockenheit nichts an ihrer Aktivität. Im Falle eines Ammoniummangels kann die Aminosäure Glycin durch ein hochaffines Aufnahmesystem als Stickstoffquelle genutzt werden.

Der Cytochrom b/f Komplex in der Thylakoidmembran ist von zentraler Bedeutung für die Regulation des Elektronentransports zwischen den beiden Photosystemen und des damit gekoppelten Protonentransports. Mit Hilfe des über Cyt b-563 verlaufenden Q-Zyklus wird das H⁺/e^- Verhältnis und in der Folge auch das ATP/NADPH Verhältnis erhöht. Die Eigenschaften des Q-Zyklus und die Mechanismen der Regulation werden bei der Isolierung von Thylakoidmembranen empfindlich gestört, so dass deren Untersuchung unter in vivo Bedingungen stattfinden muß. Derartige in vivo Untersuchungen werden aber dadurch erschwert, dass im intakten System die lichtinduzierten Absorptionsänderungen von Cyt b-563 und Cyt f von zahlreichen anderen optischen Änderungen überlagert werden. Deshalb haben wir ein spezielles kinetisches Spektralphotometer (16-Wellenlängen-LED-Array) entwickelt, mit welchem Cytochromabsorptionsänderungen über zeitaufgelöste Differenzspektren zuverlässig verfolgen werden können. Mit diesem Meßsystem haben wir die einzelnen Elektronentransportschritte im Q-Zyklus analysiert. Dabei ist es uns unter anderem gelungen, die Triorganozinn-Verbindungen als neue Klasse von Q-Zyklusinhibitoren zu  charakterisierten [78]. Diese Verbindungen scheinen die Reoxidation von Cyt b-563 dadurch zu hemmen, dass sie die Protonierung des Plastosemichinon-Anions verhindern. Weiterhin ist uns der Nachweis gelungen, dass der Cyt b/f Komplex in zwei sehr unterschiedlichen Zuständen vorliegen kann, welche sich stark in der Q-Zyklus Aktivität unterscheiden [79]. Unter normalen physiologischen Bedingungen wird Cyt b-563 nach Reduktion durch Blitzbelichtung schnell im Q-Zyklus reoxidiert. Unter oxidierenden Bedingungen erfolgt eine relativ langsame (Zeitkonstante im Minutenbereich) Umwandlung in einen Zustand, welcher durch eine extrem langsame Cyt b-563 Reoxidation gekennzeichnet ist. Eine langsame Rückkehr in den normalen Zustand erfolgt unter reduzierenden Bedingungen. Die Ergebnisse deuten auf eine bisher in dieser Weise nicht erkannte Redoxkontrolle des Cyt b/f Komplexes hin. Sie stehen in Einklang mit einem Modell funktioneller Cyt b/f Dimere, welche unter oxidierenden Bedingungen teilweise in nicht-funktionelle Monomere zerfallen.

Wenngleich das Cytochrom b-559 das häufigste Cytochrom in der Thylakoidmembran darstellt, gilt seine Funktion auch nach mehr als 30 jähriger Forschung als ungeklärt. Der Grund dafür liegt vor allem in der Tatsache, dass die lichtinduzierten Cyt b-559 Absorptionsänderungen sehr klein sind und von anderen, wesentlich größeren optischen Änderungen überlagert werden. Mit Hilfe des in unserer Arbeitsgruppe entwickelten 16-Wellenlängen-LED-Array Spektralphotometers ist es uns gelungen, neue Informationen über dieses "enigmatische Cytochrom" zu gewinnen. Während der größte Teil des Cyt b-559 als Bestandteil der Photosystem II Reaktionszentren vorliegt, ist ein kleiner Teil (ca. 13%) eng mit dem Cyt b/f Komplex assoziiert [80]. Diese Fraktion zeichnet sich durch ein besonders niedriges Redoxpotential aus, so dass sie nach Dunkelinkubation mit Ascorbat oxidiert vorliegt und erst bei Belichtung reduziert wird, wodurch sie einer systematischen Untersuchung  zugänglich wird. Wir haben gefunden, dass dieses Cyt b-559 LP durch PS I in einer Antimycin A empfindlichen Reaktion reduziert werden kann, was auf eine Rolle im zyklischen PS I Elektronenfluß schließen läßt. Die Dunkelreduktion durch NADPH erfordert die Gegenwart von Ferredoxin. Die gewonnenen Ergebnisse stehen im Einklang mit der Hypothese, dass diese spezielle Form des Cyt b-559 LP im Zusammenhang mit der Funktion einer postulierten Ferredoxin-Plastochinon Reduktase steht.

Die Hauptfraktion des Cytochrom b-559 in den PS II Reaktionszentren, welche ein hohes Redoxpotential aufweist, ist unter normalen physiologischen Bedingungen reduziert. Eine lichtinduzierte Oxidation wird nach Hemmung der PS II Donorseite beobachtet. In Gegenwart von ANT-2p kann durch einen 20 ns Laserblitz bis zu 90% des Cyt b-559 HP oxidiert werden. Aufgrund dieses Befundes kann die Existenz von 2 Molekülen Cyt b-559 pro PS II Zentrum, wie sie von verschiedenen Arbeitsgruppen gefordert wird, ausgeschlossen werden [81].

Wenn Cyt b-559 bei Donorseitenhemmung oxidiert vorliegt, kommt es im Licht zu einer deutlichen Pigmentbleichung. Unsere Meßergebnisse weisen darauf hin, dass das Cyt b-559 HP als Elektronendonor für Chlorophyll- bzw. Carotinoid-Kation-Radikale im PS II Reaktionszentrumskomplex fungiert. Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Quantenausbeute der Bildung dieser potentiell schädigenden Radikale gering und durch die reduzierende Funktion des Cyt b-559, wird eine Schädigung effektiv verhindert. Dadurch dass oxidiertes Cyt b-559 durch Plastohydrochinon wieder schnell rereduziert wird, läuft diese Funktion des Cyt b-559 ohne signifikante Absorptionsänderungen ab. Unter oxidierenden Bedingungen kann das Cyt b-559 diese wichtige Schutzfunktion jedoch nur bedingt ausüben, was Photobleichung zur Folge hat.

In Zusammenarbeit mit der Industrie haben wir neuartige optoelektronische Photosynthese-Meßsysteme mit bisher unerreichter Empfindlichkeit entwickelt. So erlaubt das neue MICROSCOPY-PAM Chlorophyllfluorometer Messungen der photosynthetischen Aktivität an Einzelzellen und einzelnen Chloroplasten [82]. Mit diesem neuen Meßsystem wurden die Eigenschaften der Schließzellen-Photosynthese untersucht, welche durch einen starken Sauerstoff-abhängigen Elektronenfluß und eine besonders enge Kopplung mit der mitochondrialen Atmung gekennzeichnet ist [2]. Die in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Sättigungspuls-Quenchanalyse ermöglicht die Messung der PS II Quantenausbeute, aus welcher die Elektronentransportrate abgeleitet werden kann.

Zur Untersuchung der Photosyntheseaktivität von Phytoplankton in natürlichen Oberflächengewässern haben wir das PHYTO-PAM Chlorophyllfluorometer entwickelt. Durch simultane pulsmodulierte Anregung der verschiedenen Photosynthesepigmente und Computer-gestützte Analyse der Fluoreszenzsignale gelingt es mit diesem neuen Meßsystem, den Gehalt an Grünalgen, Diatomeen und Cyanobakterien (z.B. im Meereswasser) zu bestimmen und deren photosynthetische Aktivität mit Hilfe der Sättigungspulsmethode zu bestimmen [82].

Während über Chlorophyllfluoreszenz-Messungen primär die Effizienz der Energieumwandlung in PS II verfolgt wird, kann mit Hilfe von P700-Messungen Information über die Effizienz der Energieumwandlung in PS I gewonnen werden. Zu diesem Zwecke haben wir ein neuartiges, hochempfindliches Zweikanal-P700-Meßsystem entwickelt [83]. Ebenso wie die Chlorophyllfluoreszenz-Methode zeichnet sich die neue P700-Methode dadurch aus, dass sie auch an intakten Zellen und Blättern angewandt werden kann.

Schließlich ist es uns die Entwicklung eines Spezialfluorometers mit pulsmoduliertem UV-Meßlicht zur Erfassung der NADPH-Fluoreszenz gelungen, mit welchem ein direkter Einblick in den Redoxzustand der PS I Akzeptorseite unter in vivo Bedingungen möglich geworden ist. Erste Untersuchungen mit diesem neuen Meßsystem wurden an Cyanobakterien durchgeführt [84]. Die  beobachteten lichtinduzierten NADPH-Änderungen zeigten eine bemerkenswerte Dynamik, in welcher sich die Wechselwirkungen von photosynthetischem und respiratorischem Elektronentransport widerspiegeln. Das neue Meßsystem ermöglicht erstmals, diese Wechselwirkungen unmittelbar unter in vivo Bedingungen zu verfolgen.

Photosynthetisch aktive endosymbiontische Organismen sind vor allem im aquatischen Lebensraum verbreitet. So enthält die Mehrzahl der riffbildenden Korallen hohe Konzentrationen der symbiontischen Dinoflagellaten Symbiodinium spp. In den vergangenen Jahren hat das Phänomen der Korallenbleichung weltweites Aufsehen erregt. Die Bleichung beruht auf einer Erniedrigung sowohl der Symbionten-Dichte als auch des Chlorophyllgehalts der einzelnen Algenzellen (Photobleichung). Wir haben mit Hilfe spezieller Chlorophyllfluoreszenz-Meßverfahren einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Korallenbleichung leisten können [85]. Dazu haben wir in Zusammenarbeit mit der Industrie ein tauchfähiges Chlorophyllfluorometer (DIVING-PAM) entwickelt, mit welchem die Photosyntheseaktivität von Korallen am natürliche Standort untersucht werden konnte [86]. Unsere bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Korallenbleichung durch eine Temperaturerhöhung von 32°C auf 34°C in Verbindung mit hohen Lichtintensitäten ausgelöst wird. Die primäre Schädigung, welche  wir im Bereich des Calvin Zyklus lokalisiert haben [85], bewirkt eine Senkung der Lichtschwelle, oberhalb welcher sekundäre Schädigungen durch Photoinhibition auftreten.

Ähnliche in situ Beobachtungen wie an Korallen haben wir auch an Lissoclinum patella , einer Seescheide mit endosymbiontischen Prochloron-Zellen, gemacht [87]. Diese symbiontischen Organismen sind von besonderem wissenschaftlichen Interesse, da sie als Prokaryonten Chlorophyll b enthalten und möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Evolution der grünen Pflanzen gespielt haben. Ihre systematische Untersuchung war bisher dadurch erschwert, dass sie außerhalb des Wirtes ihre Aktivität verlieren. Dieses Problem wird durch die nichtinvasive Chlorophyllfluoreszenzmethode überwunden. Erste in situ Messungen ergaben ungewöhnlich hohe Quantenausbeuten, welche als Ausdruck einer sehr effizienten Lichtregulation gewertet werden können [87]. Weiterhin drückt sich in den beobachteten Fluoreszenzeigenschaften von Prochloron in hospite das Wechselspiel zwischen der respiratorischen Sauerstoffaufnahme durch den Wirt und der photosynthetischen Sauerstoffentwicklung durch den Endosymbionten aus.

• Biotechnologie: Prof. Zimmermann
• Botanik II: Prof. Riederer
• Lebensmittelchemie: Dr. Schwab
• Pharmazeutische Biologie: Prof. Proksch
• Physik: Prof. Haase
• Zoologie I: Prof. Krohne

Publikationen

R. Kaldenhoff, K. Grote, J.J. Zhu and U. Zimmermann (1998) Significance of plasmalemma aquaporins for water-transport in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 14, 121-128